子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及細(xì)胞遷移和侵襲的研究.pdf

1、研究背景
　　 子宮內(nèi)膜異位癥是一種育齡婦女多發(fā)病，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，其病變廣泛，形態(tài)多樣，到目前為止發(fā)病機(jī)制不清，具有侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為，治療對策有限。
　　 模型的建立對疾病發(fā)病機(jī)制的研究是一種重要手段，在對內(nèi)異癥的研究中，盡管已成功構(gòu)建了很多模型，但仍然存在一些不足，最理想的動物模型來自獼猴和狒狒等靈長類動物，但其來源稀缺、價格昂貴，應(yīng)用受到了很大限制。而大多數(shù)動物模型所選擇的嚙齒類動物和兔

2、等無周期性月經(jīng)，不發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥，用其構(gòu)建內(nèi)異癥模型似乎并不合理。在細(xì)胞模型的建立上，單種細(xì)胞的培養(yǎng)無法模擬體內(nèi)多細(xì)胞共同作用的模式，而體外多細(xì)胞共培養(yǎng)的方法也十分有限，Transwell是應(yīng)用最為廣泛的一種方法，但其無法對兩種細(xì)胞的作用過程進(jìn)行實時觀察。
　　 本研究與中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心合作，該中心應(yīng)用微流控技術(shù)與表面化學(xué)技術(shù)已成功構(gòu)建了體外多細(xì)胞共培養(yǎng)體系，能在同一表面控制不同種細(xì)胞有序粘附，對多種細(xì)胞的微觀生物

3、學(xué)行為進(jìn)行觀察。然而目前該模型在生物學(xué)方面的應(yīng)用未見報道。將該模型應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型的研究中，可以觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞之間粘附、侵襲的發(fā)生過程，從而可以在體外模擬逆流的經(jīng)血中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入腹腔后內(nèi)異癥發(fā)病的過程，對進(jìn)一步闡釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制有重要的意義
　　 研究目的
　　 1、建立子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、腹膜間皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型。
　　 2、應(yīng)用該模型，

4、觀察內(nèi)異癥患者（研究組）及非內(nèi)異癥患者（對照組）子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞交叉共培養(yǎng)后，細(xì)胞運(yùn)動、遷移及侵襲的微觀行為，比較細(xì)胞共培養(yǎng)后行為的差異。
　　 3、實時觀塞細(xì)胞共培養(yǎng)后相互作用的過程
　　 方法：
　　 1、取組織分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞
　　 2、設(shè)計制備PDMS印章
　　 3、利用雙孔道同時接種同一種細(xì)胞，進(jìn)行愈合實驗分別觀察內(nèi)異癥及非內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)

5、胞、腹膜間皮細(xì)胞運(yùn)動的差異。
　　 4、內(nèi)異癥及非內(nèi)異癥子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞交叉共培養(yǎng)并免疫熒光標(biāo)記，每24小時拍照，比較兩組細(xì)胞行為差異。
　　 5、顯微鏡實時監(jiān)測共培養(yǎng)體系中兩細(xì)胞相互作用的過程。
　　 6、嘗試應(yīng)用建立的模型探討17β雌二醇、孕酮、Triptorelin對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及與腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞運(yùn)動的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、當(dāng)孔道寬、高300μm時，孔道

6、間距500μm，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞密度5×106/1、腹膜間皮細(xì)胞3×105/1時在孔道內(nèi)生長良好，2小時可貼壁牢固，揭膜后圖案化好。
　　 2、模型設(shè)計當(dāng)愈合孔道寬度600μm時，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞93小時兩細(xì)胞條帶可完全愈合，在內(nèi)異癥組及非內(nèi)異癥組無明顯差異；腹膜問皮細(xì)胞24小時已完全愈合，運(yùn)動速度快于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。
　　 3、內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，基質(zhì)細(xì)胞向腹膜間皮細(xì)胞遷移，使腹膜間皮細(xì)

7、胞數(shù)量減少，甚至消失
　　 4、內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與非內(nèi)異癥患者腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)，腹膜間皮細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞方向遷移，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少
　　 5、非內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)異癥患者腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)，基質(zhì)細(xì)胞同樣可以使腹膜間皮細(xì)胞減少消失
　　 6、非內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)，兩細(xì)胞各自生長，未觀察到侵襲現(xiàn)象
　　 7、17β雌二醇濃度為5nM及10nM，Tripto

8、relin濃度為5×10-7g/ml時子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動距離與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異；孕酮對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動無影響。17β雌二醇濃度為10nM時，可加快子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞運(yùn)動速度。
　　 結(jié)論：
　　 1、本課題應(yīng)用微流控技術(shù)成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型。能在細(xì)胞學(xué)水平對兩細(xì)胞作用過程進(jìn)行實時觀察。
　　 2、通過研究組、對照組了富內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)交叉共培養(yǎng)得出子宮