生長分化因子11對神經細胞增殖、分化的影響及作用機制的初探.pdf

1、目的：
　　本研究選擇生長分化因子11（Growth differentiation factor11，GDF11）與C-C型趨化因子配體11(C-C motif chemokine ligand11，CCL11)兩個蛋白進行研究，首先對文獻中報道的R&D公司GDF11抗體的特異性進行檢測;然后檢測正常獻血者血漿中GDF11和CCL11的含量，分析人血液中GDF11和CCL11水平與年齡、性別、血型等的相關性;利用HT22和C17

2、.2小鼠神經細胞，明確GDF11對神經干細胞凋亡、壞死、遷移、增殖、分化等的作用，研究GDF11發(fā)揮作用的信號通路，初步闡述其作用機制，探討GDF11在年齡相關的認知功能減退中潛在的應用價值，為后續(xù)轉化醫(yī)學研究奠定理論基礎。
　　方法：
　　1.采用SDS-PAGE及Western blot方法檢測R&D公司GDF11抗體是否具有特異性。
　　2.收集約300例不同年齡、性別、血型的正常獻漿人群的單人份新鮮冰凍血漿，-

3、80℃凍存，待用，避免反復凍融。采用ELISA方法檢測血漿中GDF11、CCL11的含量，明確人血液中GDF11與CCL11的含量與年齡、性別、血型等的相關性。
　　3.用完全培養(yǎng)基（含5％馬血清、10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）將小鼠海馬神經細胞系HT22或神經干細胞系C17.2在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，更換為饑餓培養(yǎng)基（含1％胎牛血清和0.5％馬血清的高糖DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后①HT22細胞實驗組:棄去原

4、有培養(yǎng)基，加入含有不同濃度GDF11(12.5、25、50、100ng/mL)的饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng);C17.2細胞實驗組:分別加100ng/mL NGF，100ng/mL GDF11，25ng/mL GDF11。②對照組:棄去原有培養(yǎng)基，加入與實驗組相同體積的饑餓培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)6h，24h，36h或48h后，分別進行如下實驗。
　　4.GDF11處理96孔板中的HT22和C17.2細胞24h或48h后，倒置熒光顯微鏡觀察GDF11對

5、細胞形態(tài)的影響，通過Hoechst和PI雙染法測定細胞凋亡和壞死情況，采用增強型CCK8法檢測細胞活力及增殖情況。
　　5.對24孔板中的HT22細胞進行人為劃痕損傷實驗，觀察損傷后不同濃度GDF11(12.5，25，50，100ng/mL)對細胞向劃痕處遷移能力的影響。
　　6.通過實時定量PCR(qRT-PCR)檢測GDF11刺激12孔板中的HT22和C17.2細胞6h后細胞周期蛋白CyclingD2、神經干細胞標志蛋白

6、nestin、神經元標志蛋白βⅢ-Tubulin、星形膠質細胞標志蛋白GFAP及信號通路蛋白EGFR、Notch1等的mRNA表達情況。
　　7.利用Western blot方法分析GDF11刺激6孔板中的HT22細胞后對TGF-β信號通路中的Smad2/3以及cAMP應答元件結合蛋白Creb等蛋白的磷酸化的影響。
　　8.統(tǒng)計學分析:采用GraphPad Prism5軟件進行圖表繪畫及數(shù)據統(tǒng)計分析。Western blot

7、條帶采用Image J軟件進行灰度分析。目的條帶灰度值經對應的內參調整后，計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值，同時將正常對照組磷酸化蛋白/總蛋白的比值設定為1，然后進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，雙組間的比較采用配對t檢驗。當P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.Western blot結果顯示:R&D公司的GDF11單克隆抗體可結合GDF8，但與IgG單鏈不具有交叉反應。
　　2.ELIS

8、A結果顯示:人血漿中GDF11水平隨年齡增加呈遞減趨勢，CCL11含量則隨年齡的增加而增加，并且在男性中顯著高于女性(P＜0.01)，但血型間并無差異。
　　3.Hoechst和PI雙染結果顯示:GDF11對HT22細胞凋亡、壞死無影響。
　　4.增強型CCK8檢測結果顯示:不同濃度GDF11處理海馬神經細胞系HT22和神經干細胞系C17.248h后，均表現(xiàn)出細胞活力增強，且有顯著性差異(P＜0.01)，但并無劑量依賴。

9、r>　　5.劃痕損傷實驗結果:GDF11處理組遷移至劃痕損傷處的細胞數(shù)量相對對照組較少。
　　6.qRT-PCR結果顯示:與對照組相比，不同濃度GDF11處理細胞6h后，神經元標志物βⅢ-Tubulin mRNA表達水平明顯增加(P＜0.01，n=3)，但沒有劑量依賴性;細胞干性標志物Nestin表達有所下降，星形膠質細胞標志物GFAP有所增加，但無統(tǒng)計學差異;細胞周期標志物CyclinD2表達下調(P＜0.05，n=3)，但沒有

10、劑量依賴性;EGFR、Notch1表達下降，有顯著性差異(P＜0.05)，且有劑量依賴性，表明GDF11可能通過抑制EGFR和Notch等信號通路對神經干細胞的增殖分化進行調控。
　　7.Western blot結果顯示:GDF11組（處理24h）與對照組相比，Smad2/3和Creb蛋白表達無明顯變化，p-Smad2/3、p-Creb蛋白表達均顯著增加，但無顯著的劑量依賴性，表明不同濃度的GDF11均可激活Smad2/3和Cre

11、b的磷酸化，可能通過啟動TGF-β/Smad2/3、Creb等信號通路對小鼠海馬神經細胞的增殖分化進行調控。
　　結論：
　　1.文獻報道中的R&D公司的GDF11單克隆抗體不能辨別GDF11和GDF8，但也不會結合IgG輕鏈。
　　2.人血漿中GDF11含量隨年齡增加有遞減趨勢，CCL11含量隨年齡增加而增加，且在相同年齡的前提下男性血漿中含量高于女性，血型之間無差異。
　　3.GDF11可能通過抑制Notch