美達(dá)霉素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶Med-ORF8定點(diǎn)突變及功能分析.pdf

1、美達(dá)霉素(medermycin)是由鏈霉菌(Streptomyces sp AM-7161)產(chǎn)生的芳香聚酮抗生素，具有一定的抗菌抗腫瘤活性。美達(dá)霉素聚酮母核通過(guò)稀有的C-C糖苷鍵與脫氧糖胺相連。前期實(shí)驗(yàn)表明美達(dá)霉素生物合成基因簇中的基因med-ORF8是其生物合成必須基因，初步推斷med-ORF8編碼一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶(Med-ORF8)，負(fù)責(zé)C-糖苷鍵的形成，但目前對(duì)其結(jié)構(gòu)以及酶學(xué)機(jī)制尚未闡明。本文利用生物信息學(xué)、基因定點(diǎn)突變和原核表達(dá)等

2、方法對(duì)Med-ORF8進(jìn)行初步研究，主要包括以下幾方面的內(nèi)容：
　　 (1)Med-ORF8生物信息學(xué)分析
　　 為了確定Med-ORF8中的突變位點(diǎn)，首先對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析：同源性分析認(rèn)為其屬于C-糖基轉(zhuǎn)移酶家族，通過(guò)對(duì)Med-ORF8的氨基酸組成、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、親疏水性等基本參數(shù)的分析，表明Med-ORF8的376個(gè)氨基酸中丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和纈氨酸含量最多，占到了總量的70

3、.9％；理論等電點(diǎn)為5.84，不穩(wěn)定系數(shù)為55.49，平均親水性-0.076，說(shuō)明Med-ORF8應(yīng)屬于不穩(wěn)定的酸性疏水蛋白；在線分析Med-ORF8的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明Med-ORF8共有11個(gè)β折疊、14個(gè)α螺旋。三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析表明Med-ORF8與UrdGT2(烏達(dá)霉素合成中的C-糖基轉(zhuǎn)移酶)單體結(jié)構(gòu)相似。
　　 (2)大引物PCR定點(diǎn)突變方法的改進(jìn)及Med-ORF8定點(diǎn)突變
　　 利用ClustalW(http：/

4、/align.genome.jp/)在線對(duì)三種糖基轉(zhuǎn)移酶(即C-、O-及N-糖基轉(zhuǎn)移酶)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，初步確定將Med-ORF8的I307突變?yōu)镈307(天冬氨酸)。
　　 為了對(duì)Med-ORF8進(jìn)行點(diǎn)突變，首先對(duì)大引物PCR定點(diǎn)突變方法進(jìn)行改進(jìn)，主要包括：(1)用含有目的基因的質(zhì)粒做模板，從長(zhǎng)度上區(qū)別突變產(chǎn)物和原始模板；(2)避免在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)使用擴(kuò)增全長(zhǎng)基因的常規(guī)引物；(3)選擇含不同抗性基因的不同載體克

5、隆原始基因和突變基因，通過(guò)抗性選擇篩選突變子，從而完全避免原始基因的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用改進(jìn)后的方法進(jìn)行基因點(diǎn)突變，可以減少操作步驟，提高突變頻率。利用改進(jìn)的大引物PCR法成功將美達(dá)霉素糖基轉(zhuǎn)移酶Med-ORF8307位的異亮氨酸(I)突變?yōu)樘於彼?D)(獲得的帶突變點(diǎn)的med-ORF8命名為med-ORF8*)。
　　 (3)med-ORF8*的原核表達(dá)體系的建立和優(yōu)化
　　 將點(diǎn)突變的糖基轉(zhuǎn)移酶基因med-ORF

6、8*插入原核表達(dá)載體pET-28a的NdeI和HindⅢ之間構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pHSL74-6，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得原核表達(dá)工程菌株。優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定：med-ORF8*在大腸桿菌中大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物(Med-ORF8*)的分子量約43 KD。用0.05 mM IPTG或0.05％的乳糖在8℃條件下誘導(dǎo)20-24 h，Med-ORF8*形成包涵體的量減少，可溶性含量較高。
　　 (4)點(diǎn)突變Med-ORF8

7、*功能初步驗(yàn)證
　　 將突變基因med-ORF8*克隆到鏈霉菌表達(dá)載體pWHM4*的XbaI和EcoRV之間構(gòu)建了鏈霉菌表達(dá)質(zhì)粒pHSL73-2，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將pHSL73-2轉(zhuǎn)化到med-ORF8基因缺失的基因簇異源表達(dá)系統(tǒng)中(即突變菌株天藍(lán)色鏈霉菌CH999/pHSL3。質(zhì)粒pHSL3含有美達(dá)霉素基因簇，但上面的med-ORF8被阿泊拉霉素抗性基因取代)。獲得轉(zhuǎn)化子在R4產(chǎn)素培養(yǎng)基上都能產(chǎn)生特征性色素(表明回補(bǔ)后還能產(chǎn)生

8、一定的美達(dá)霉素)，是否有其它結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物出現(xiàn)還有待分析。
　　 (5)美達(dá)霉素產(chǎn)生菌中與美達(dá)霉素合成相關(guān)化合物的分析
　　 將美達(dá)霉素產(chǎn)生菌鏈霉菌AM-7161的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC/MS分析，發(fā)現(xiàn)除美達(dá)霉素之外，還明顯積累一個(gè)未知化合物X，且與美達(dá)霉素生物合成基因簇相關(guān)，可能為美達(dá)霉素合成中的旁路產(chǎn)物或中間體或次級(jí)組分。從質(zhì)譜和全波長(zhǎng)吸收?qǐng)D譜分析為含芳香結(jié)構(gòu)的分子量為300的化合物。目前對(duì)這個(gè)X化合物的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化