人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞胞漿及胞膜差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：建立HPV-16陽性的宮頸上皮永生化細(xì)胞(H8細(xì)胞株)和宮頸癌細(xì)胞(Caski細(xì)胞株)胞漿和胞膜蛋白雙向電泳圖譜，將二者進(jìn)行比較，篩選出差異表達(dá)蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，為宮頸癌癌變機(jī)制和抗癌藥物靶點的選擇提供信息和幫助。 方法： 1、將H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞置于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，待細(xì)胞數(shù)約達(dá)到3×106時收集細(xì)胞，加入亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)提取試劑分別提取胞漿和胞膜蛋白質(zhì)。 2、用雙向凝膠電泳(2

2、-dimensional gel electrophoresis，2-DE)分別分離H8和Caski細(xì)胞的胞漿和胞膜蛋白質(zhì)，經(jīng)銀染后用ImageMaster 2D軟件進(jìn)行圖像分析，尋找出顯著差異蛋白點。 3、對差異表達(dá)蛋白斑點用胰酶進(jìn)行酶切，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)分析酶切片斷，得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF)，使用國際互聯(lián)網(wǎng)上Matrix Science公司提供的PMF鑒定程序進(jìn)行查詢鑒定。

3、 結(jié)果： 1、通過亞結(jié)構(gòu)蛋白提取方法和雙向電泳技術(shù)獲得了清晰的、分辨率高和重復(fù)性好的H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞胞漿和胞膜蛋白質(zhì)表達(dá)的二維凝膠電泳圖譜。 2、通過ImageMaster 2D V2002.1圖像分析軟件分析，對H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞胞漿2-DE圖譜進(jìn)行膠間的斑點匹配，發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞胞漿蛋白質(zhì)凝膠圖像蛋白斑點主要集中在PI為4～8和分子量為10～180KD，H8細(xì)胞胞漿蛋白斑點總數(shù)約為1123個，Caski

4、細(xì)胞胞漿蛋白斑點總數(shù)約為1231個，匹配率為70％。比較兩個圖譜發(fā)現(xiàn)有8個蛋白點的在胞漿表達(dá)中存在明顯的差異。而在兩株細(xì)胞胞膜蛋白質(zhì)凝膠圖像中蛋白斑點主要集中在PI為4～9和分子量為10～200KD，H8細(xì)胞胞膜蛋白斑點總數(shù)約為1107個，Caski細(xì)胞胞膜蛋白斑點總數(shù)約為1033個，匹配率為71％。比較兩個圖譜發(fā)現(xiàn)有13個蛋白點的在胞膜表達(dá)中存在差異。 3、對H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞的胞漿蛋白2-DE圖譜進(jìn)行比較，找到8個顯著

5、差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點，對其進(jìn)行質(zhì)譜分析，初步鑒定出6種差異蛋白質(zhì)，它們分別是：S 100P、Ikkb(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit)、CDK6(Cell division protein kinase 6)、TAF2(Transcription initiation factor TFIID subunit 2)、 STK3(Serine/threonine-pro

6、tein kinase 3)、TRAF5(TNF receptor-associatedfactor 5)。其中STK3、TRAF5在宮頸癌細(xì)胞株胞漿中蛋白質(zhì)表達(dá)缺失，S100P、Ikkb、CDK6、TAF2在宮頸癌細(xì)胞株胞漿中蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。 4、對H8細(xì)胞和Caski細(xì)胞的胞膜蛋白2-DE圖譜進(jìn)行比較，篩選出13個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點，對其進(jìn)行質(zhì)譜分析，初步鑒定出3種差異蛋白質(zhì)，它們分別是：LRC8D(Leucine-ric

7、h repeat-containingprotein 8D)、EDAR(Tumor necrosis factor receptor superfamily memberEDAR precursor)、Metaxin-1，它們均在宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞株胞膜中蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：在宮頸癌前病變到癌變過程中基因和其相應(yīng)的蛋白質(zhì)發(fā)生了很大的變化，對人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞(H8)和宮頸癌細(xì)胞(Caski)2-DE圖譜進(jìn)行比較，篩

8、選鑒定出了6種差異胞漿蛋白和3種差異胞膜蛋白，其中S100P，IKKb，CDK6，TAF2這4種蛋白質(zhì)在宮頸癌細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，可能是通過在細(xì)胞增值、分化、抑制細(xì)胞凋亡、加快細(xì)胞周期造成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控和細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而STK3,TRAF5蛋白質(zhì)在宮頸癌細(xì)胞胞漿中表達(dá)缺失和LRC8D，EDAR，Metaxin-1在宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞胞膜中高表達(dá)可能與它們促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程及抑制細(xì)胞異常增殖等密切相關(guān)，從而抑制腫瘤形