TRAIL調(diào)節(jié)SGC7901-DDP中MRP1表達(dá)及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：近年來,全球多數(shù)地區(qū)胃癌的發(fā)病率和死亡率有下降趨勢(shì),但胃癌仍嚴(yán)重地威脅著人類的健康?；熓俏赴┑闹匾委熓侄沃?可提高胃癌患者的總生存率和生活質(zhì)量。但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)往往導(dǎo)致化療的失敗。其中,多藥耐藥蛋白1(Multidrug resistance protein1,MRP1)與胃癌細(xì)胞的MDR之間有密切的聯(lián)系。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-relat

2、ed apoptosis inducing ligand,TRAIL)可選擇性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡,而對(duì)正常細(xì)胞僅有輕微或無殺傷作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及MDR有著密切的關(guān)系。研究表明腫瘤細(xì)胞中MRP1的表達(dá)與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān),通過PI3K抑制劑LY294002抑制細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路可下調(diào)MRP1的表達(dá)。有大量關(guān)于TRAIL與PI3K/Akt信號(hào)通路之

3、間關(guān)系的研究,普遍認(rèn)為TRAIL可以下調(diào)pAkt的表達(dá),但關(guān)于TRAIL是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路來調(diào)節(jié)MRP1的表達(dá)的研究,目前尚無相關(guān)報(bào)道。我們前期的研究認(rèn)為TRAIL可以下調(diào)多藥耐藥基因及蛋白的表達(dá),現(xiàn)為進(jìn)一步探討TRAIL下調(diào)多藥耐藥蛋白表達(dá)的機(jī)制,我們以pAVV為載體,將sTRAIL基因?qū)胛赴┘?xì)胞SGC7901/DDP內(nèi),加(或不加)LY294002處理,觀察其對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP MRP1 mRNA

4、、MRP1、pAkt及Akt蛋白的影響,探討可能的作用機(jī)制。
　　目的：將pAVV-sTRAIL導(dǎo)入胃癌細(xì)胞株SGC7901/DDP,使TRAIL在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),并探討TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP的多藥耐藥現(xiàn)象及可能的作用機(jī)制。
　　方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)胃癌耐長(zhǎng)春新堿細(xì)胞株 SGC7901/DDP培養(yǎng)于含10％胎牛血清、青/鏈霉素濃度為100 U/ml的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,37℃、5% CO2、飽

5、和濕度下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。上述培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上常規(guī)加入終濃度為1.0μg/ml DDP維持其耐藥性,試驗(yàn)前撤藥培養(yǎng)2周。
　　2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將SGC7901/DDP以2×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,用無抗生素完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至次日對(duì)數(shù)期,細(xì)胞融合度為70~80%時(shí),按 LipofectamineTM2000試劑盒操作說明,分別以空載體pAVV-EGFP及pAVV-sTRAIL轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP,用無血清培養(yǎng)基,37℃、5%CO

6、2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5~6 h后,換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞為SGC7901/DDP組;轉(zhuǎn)染不含sTRAIL基因的為pAVV-EGFP組;轉(zhuǎn)染含sTRAIL基因的為pAVV-sTRAIL組;未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒加用LY294002的為 LY294002組;轉(zhuǎn)染sTRAIL基因并加 LY294002為pAVV-sTRAIL+LY294002組。
　　4、MTT檢測(cè)細(xì)胞IC50檢測(cè)SGC7901/

7、DDP組、pAVV-EGFP組及pAVV-sTRAIL組細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值。消化轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞,調(diào)整為(5~10)×104個(gè)/ml,以100μl/孔接種到96孔板中,待貼壁6～8 h后加入不同濃度的順鉑,48 h后加入MTT(5 mg/ml)20μl/孔,培養(yǎng)4 h后棄上清液,每孔加入DMSO150μl。用酶標(biāo)儀(490 nm波長(zhǎng))測(cè)每孔的OD(A)值,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用GraphPad Prism5計(jì)算IC50值。

8、　　5、RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)變化分別收集轉(zhuǎn)染后24、48及72 h的細(xì)胞,按照TRIzol說明書,提取細(xì)胞總RNA,取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃60 min,70℃5 min,合成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。?μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件為sTRAIL:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,54℃退火50 s,72℃延伸30 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),72℃最終延

9、伸10 min;MRP1:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,60℃退火50 s,72℃延伸30 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),72℃最終延伸10 min。分別檢測(cè)帶有目的基因的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及各組細(xì)胞中MRP1 mRNA的表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。
　　6、WB檢測(cè)各組細(xì)胞各蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分兩批進(jìn)行:1)三組細(xì)胞分別為SGC7901/DDP、 pAVV-EGFP及pAVV-sTRAIL組,72 h后

10、收集各組細(xì)胞;2)五組細(xì)胞分別為SGC7901/DDP、 pAVV-EGFP、pAVV-sTRAIL、LY294002及pAVV-sTRAIL+LY294002,在轉(zhuǎn)染后48 h向培養(yǎng)孔內(nèi)加(或不加)LY294002,作用24 h后收集各組細(xì)胞。用含PMSF的裂解液于冰上裂解細(xì)胞30min后,4℃12,000 r/min離心10min,取上清液,和上樣緩沖液混合煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE,將電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加5

11、%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入TRAIL、MRP1、pAkt及Akt,4℃孵育過夜。濾膜經(jīng)緩沖液清洗3次后,與二抗于室溫孵育1 h。充分洗膜,應(yīng)用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯影,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析,以β-actin作為內(nèi)參照。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得到的數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,兩組均值比較采用t檢驗(yàn),多組均數(shù)比較用單因素方差分析。
　　結(jié)果：1、 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)DDP的IC

12、50值根據(jù)MTT結(jié)果做出各組細(xì)胞的生存曲線,并計(jì)算各組細(xì)胞對(duì) DDP的IC50值,結(jié)果表明,pAVV-sTRAIL組與SGC7901/DDP組及pAVV-EGFP組相比較,細(xì)胞IC50值明顯下降(分別為1.175、4.667和4.657),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞檢測(cè)質(zhì)粒內(nèi)的目的基因,結(jié)果顯示:pAVV-sTRAIL組細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到大量 TRAIL mRNA,SGC7901/DDP組

13、及pAVV-EGFP組均未見表達(dá);分別收集轉(zhuǎn)染后24、48及72 h細(xì)胞檢測(cè)MRP1 mRNA的表達(dá),結(jié)果表明隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),MRP1 mRNA的表達(dá)逐漸下降,且較SGC7901/DDP組及pAVV-EGFP組均明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、WB檢測(cè)各組細(xì)胞各蛋白的表達(dá)收集 SGC7901/DDP、轉(zhuǎn)染 pAVV-EGFP及pAVV-sTRAIL后72h的細(xì)胞做WB結(jié)果表明:pAVV-sTRAIL組中TRAIL蛋白大量

14、表達(dá),SGC7901/DDP組及 pAVV-EGFP組幾乎無表達(dá);pAVV-sTRAIL組、LY294002組及pAVV-sTRAIL+ LY294002組中MRP1蛋白及pAkt蛋白的表達(dá)較SGC7901/DDP組及pAVV-EGFP組明顯減少,而Akt在各組之間無明顯差異。
　　結(jié)論：1、本研究結(jié)果顯示:TRAIL轉(zhuǎn)染能增強(qiáng)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP對(duì)順鉑的敏感性,表明上調(diào)細(xì)胞內(nèi)TRAIL的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞SGC79