C1EIS基因對雞ESC向雄性生殖細胞分化的調控作用.pdf

1、胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖細胞的誘導分化受到許多內源性分化因子和外源誘導因素的調控。其中視黃酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源誘導培養(yǎng)與Stra8、DAZL等內源基因調控形成復雜調控網(wǎng)絡共同發(fā)揮關鍵作用。隨著對ESC向雄性生殖細分化機制的深入了解，發(fā)現(xiàn)存在新基因特異表達，探索這些新基因功能對完善胚胎干細胞

2、誘導體系，治療不孕不育疾病具有重要意義。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因編輯技術實現(xiàn)在雞上基因敲除，探索精原干細胞特異表達基因C1EIS功能，為闡明生殖細胞發(fā)生及分化機制提供高效方法。本文主要研究如下:
　　1前期通過RNA-seq技術發(fā)現(xiàn)C1EIS基因在ESC向SSC分化過程中，存在顯著差異表達。通過RT-PCR獲得如皋黃雞C1EIS基因編碼區(qū)并進行測序驗證。生物信息學分析結果表明:C1EIS基因(基因登錄號:XM_41

3、6004.2)編碼144個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白無信號肽，主要在細胞核中表達。存在2個O-糖基化位點和1個N-糖基化位點，可能含有磷酸化位點;二級結構中α螺旋占45.14％，β轉角占4.17％，伸展片段占15.97，無規(guī)則卷曲占34.72％;系統(tǒng)進化樹分析顯示雞C1EIS蛋白與綠頭鴨進化關系密切，與牛等哺乳類動物同源性較低。
　　2設計3對特異sgRNA序列，構建CRISPR/Cas9敲除載體。使用含1.7％

4、 DMSO培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)細胞48小時后轉染CRISPR/Cas9載體。利用菌液PCR，T7E1酶切和TA克隆測序檢測CRISPR/Cas9敲除載體活性。結果表明C1EIS基因存在2-3bp堿基缺失，突變效率為20％。CRISPR/Cas9技術能夠穩(wěn)定的在雞的細胞上實現(xiàn)C1EIS基因突變。利用qPCR克隆C1EIS基因，連接pcDNA3.0過表達載體。利用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切獲得C1EIS條帶，表明pcDNA3.0-C1EIS過表達

5、載體構建成功。
　　3分別將CRISPR/Cas9載體，pcDNA3.0-C1EIS過表達載體轉染ESC，轉染48小時后換RA誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)12天。采用形態(tài)學觀察、免疫化學檢測、流式細胞檢測和QRT-PCR等方法檢測C1EIS缺失與過表達對ESC向SSC分化的影響。結果表明C1EIS缺失的ESC與正常RA誘導組相比，第6天類胚體數(shù)目降低57％，且停止向SSC分化;第12天RA誘導組與過表達組形成類SSC，C1EIS敲除組無類SSC

6、形成;細胞免疫化學檢測表明C1EIS缺失導致integrinα6、integrinβ1蛋白表達量低于正常RA誘導組;流式分選結果表明C1EIS缺失integrinα6、integrinβ1雙陽性細胞數(shù)為0.1％，對照組與過表達組為20.8％和19.7％。熒光定量PCR結果表明誘導4d后，C1EIS缺失組Sox2和Nanog基因表達量顯著高于正常RA誘導組51％和42％;誘導12d后，integrinα6和integrinβ1基因表達量顯