C1EIS基因?qū)﹄uESC向雄性生殖細(xì)胞分化的調(diào)控作用.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）向雄性生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化受到許多內(nèi)源性分化因子和外源誘導(dǎo)因素的調(diào)控。其中視黃酸(Retinoic acid，RA)、骨形成蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)等外源誘導(dǎo)培養(yǎng)與Stra8、DAZL等內(nèi)源基因調(diào)控形成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著對(duì)ESC向雄性生殖細(xì)分化機(jī)制的深入了解，發(fā)現(xiàn)存在新基因特異表達(dá)，探索這些新基因功能對(duì)完善胚胎干細(xì)胞

2、誘導(dǎo)體系，治療不孕不育疾病具有重要意義。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)在雞上基因敲除，探索精原干細(xì)胞特異表達(dá)基因C1EIS功能，為闡明生殖細(xì)胞發(fā)生及分化機(jī)制提供高效方法。本文主要研究如下:
　　1前期通過(guò)RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)C1EIS基因在ESC向SSC分化過(guò)程中，存在顯著差異表達(dá)。通過(guò)RT-PCR獲得如皋黃雞C1EIS基因編碼區(qū)并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:C1EIS基因(基因登錄號(hào):XM_41

3、6004.2)編碼144個(gè)氨基酸，屬于不穩(wěn)定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白無(wú)信號(hào)肽，主要在細(xì)胞核中表達(dá)。存在2個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，可能含有磷酸化位點(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占45.14％，β轉(zhuǎn)角占4.17％，伸展片段占15.97，無(wú)規(guī)則卷曲占34.72％;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示雞C1EIS蛋白與綠頭鴨進(jìn)化關(guān)系密切，與牛等哺乳類(lèi)動(dòng)物同源性較低。
　　2設(shè)計(jì)3對(duì)特異sgRNA序列，構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體。使用含1.7％

4、 DMSO培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體。利用菌液PCR，T7E1酶切和TA克隆測(cè)序檢測(cè)CRISPR/Cas9敲除載體活性。結(jié)果表明C1EIS基因存在2-3bp堿基缺失，突變效率為20％。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠穩(wěn)定的在雞的細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)C1EIS基因突變。利用qPCR克隆C1EIS基因，連接pcDNA3.0過(guò)表達(dá)載體。利用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切獲得C1EIS條帶，表明pcDNA3.0-C1EIS過(guò)表達(dá)

5、載體構(gòu)建成功。
　　3分別將CRISPR/Cas9載體，pcDNA3.0-C1EIS過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ESC，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后換RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)12天。采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫化學(xué)檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)和QRT-PCR等方法檢測(cè)C1EIS缺失與過(guò)表達(dá)對(duì)ESC向SSC分化的影響。結(jié)果表明C1EIS缺失的ESC與正常RA誘導(dǎo)組相比，第6天類(lèi)胚體數(shù)目降低57％，且停止向SSC分化;第12天RA誘導(dǎo)組與過(guò)表達(dá)組形成類(lèi)SSC，C1EIS敲除組無(wú)類(lèi)SSC

6、形成;細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)表明C1EIS缺失導(dǎo)致integrinα6、integrinβ1蛋白表達(dá)量低于正常RA誘導(dǎo)組;流式分選結(jié)果表明C1EIS缺失integrinα6、integrinβ1雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0.1％，對(duì)照組與過(guò)表達(dá)組為20.8％和19.7％。熒光定量PCR結(jié)果表明誘導(dǎo)4d后，C1EIS缺失組Sox2和Nanog基因表達(dá)量顯著高于正常RA誘導(dǎo)組51％和42％;誘導(dǎo)12d后，integrinα6和integrinβ1基因表達(dá)量顯