日本沼蝦C型凝集素及其配體螺原體糖基化蛋白的功能研究.pdf

1、日本沼蝦（Macrobrachium nipponensis）又名青蝦或河蝦，在眾多沼蝦屬中是最有發(fā)展前途的物種之一。然而，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，密度不斷增加，其患病的幾率也大大增加。日本沼蝦的病原種類(lèi)較多，主要是細(xì)菌、病毒，引起的病害也越來(lái)越嚴(yán)重。近年來(lái)，螺原體作為一種新型的致病菌受到廣大學(xué)者的關(guān)注。中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）能導(dǎo)致中華絨螯蟹（又稱(chēng)河蟹）患“顫抖病”，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)

2、展。王文等進(jìn)一步證實(shí)了中華絨螯蟹螺原體不僅是河蟹“顫抖病”的致病菌，也是克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、南美白對(duì)蝦(Penacus vannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)和日本沼蝦等水生甲殼動(dòng)物的致病菌。日本沼蝦缺少免疫球蛋白，其防御機(jī)制完全依賴(lài)先天性免疫系統(tǒng)，C型凝集素作為一類(lèi)很重要的免疫因子被大家所熟知。同時(shí)凝集素作為糖結(jié)合蛋白，可以用來(lái)篩選糖基化蛋白。本論文首先從日

3、本沼蝦中篩選了三種C型凝集素，并通過(guò)基因克隆、序列分析、體外蛋白表達(dá)以及其功能特征，研究了其免疫抗菌機(jī)制。其次通過(guò)Far-western技術(shù)篩選了三種與C型凝集素相互作用的螺原體糖基化蛋白，并對(duì)其進(jìn)行體外重組表達(dá)、多克隆抗體制備，MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步研究了凝集素的抗菌能力和在螺原體侵染過(guò)程中的作用。本論文具體的實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容將從以下三個(gè)方面開(kāi)展:
　　1.C型凝集素的序列特性及功能研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)從日本沼蝦得到三種C

4、型凝集素，命名為MnCTLDcp1、MnCTLDcp2、MnCTLDcp3，通過(guò)序列分析得知這三種C型凝集素均含有特征性CTLD結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果顯示MnCTLDcp1和MnCTLDcp2均在心臟中表達(dá)量最高，MnCTLDcp3在肝胰腺中有最高的表達(dá)量。細(xì)菌刺激后三種凝集素表達(dá)量迅速上調(diào)并且在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值，將靶基因沉默后再用嗜水氣單胞菌刺激，其表達(dá)量明顯下調(diào)，說(shuō)明三種C型凝集素參與了日本沼蝦的抗菌反應(yīng)。另外，體外重組表達(dá)的

5、凝集素可以凝集并結(jié)合不同的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了C型凝集素在日本沼蝦的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用。
　　2.C型凝集素篩選螺原體糖基化蛋白
　　本實(shí)驗(yàn)先提取螺原體總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE膠分離后再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用三種重組C型凝集素分別孵育，經(jīng)TMB顯色之后，與對(duì)照相比找出差異的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，即篩選了與C型凝集素相互作用的三種螺原體糖基化修飾蛋白，分別為ATP合酶β亞基(ATP

6、 synthase subunit beta)、分子伴侶DnaK(molecular chaperone DnaK)、果糖-二磷酸醛縮酶（fructose-bisphosphate aldolase）。以篩選得到的三種螺原體糖基化蛋白為主要研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行基因克隆、體外原核表達(dá)，得到三種純化的重組蛋白。通過(guò)Far-western技術(shù)體外驗(yàn)證了螺原體糖基化蛋白和C型凝集素的相互作用，結(jié)果顯示三種糖基化蛋白與MnCTLDcp3的結(jié)合效果最

7、好，與MnCTLDcp1的結(jié)合能力最弱。
　　3.螺原體糖基化蛋白功能特性研究
　　在本部分實(shí)驗(yàn)中，選取MnCTLDcp3進(jìn)行S2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀技術(shù)再次驗(yàn)證了其與三種糖基化蛋白的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)想結(jié)果一致。另外，對(duì)三種螺原體糖基化蛋白進(jìn)行多克隆抗體制備，并驗(yàn)證了它們?cè)诩?xì)胞膜上均有大量分布。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中通過(guò)用抗體將螺原體包被削減了其侵染力從而使細(xì)胞有更好的存活率，進(jìn)一步驗(yàn)證了螺原體侵染宿主的過(guò)程中，螺原體