截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后心肌及線粒體損傷的機制及保護.pdf

1、背景與目的：應(yīng)激是機體對有害刺激(應(yīng)激原)所做出的適應(yīng)性綜合反應(yīng)。機體在受到外界刺激如燒傷．缺血再灌注以及手術(shù)等創(chuàng)傷應(yīng)激后，可以引起一系列神經(jīng)內(nèi)分泌的激活、氧化應(yīng)激以及細胞內(nèi)的Ca2+超載，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(Ald)、內(nèi)皮素(ET-1)以及各種細胞因子和活性氧自由基，從而引起應(yīng)激性高血壓、應(yīng)激性心律失常、應(yīng)激性心肌缺血、心功能障礙等。肢體創(chuàng)傷也是一種應(yīng)激狀態(tài)，心血管系統(tǒng)是多種應(yīng)激因素作用的重要靶器官。

2、 本實驗用手術(shù)的方法建立大鼠的左后肢截肢創(chuàng)傷應(yīng)激模型，動態(tài)檢測血漿H2S、NO、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，丙二醛(MDA)、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)的變化，檢測心肌CSE、MPO活性及MDA、ALD含量，并用RT-PCR的方法檢測心肌CaNmRNA的表達，觀察心肌組織CaNAβ基因表達的變化，同時光鏡下觀察心肌的病理損傷，電鏡觀察心肌

3、線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。并應(yīng)用H2S供體NaHS、CSE抑制劑PPG、CaN抑制劑FK506及醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯進行干預(yù)，觀察上述指標(biāo)及線粒體呼吸功能、膜電位及線粒體總ATP酶的變化，進一步研究H2S，CaN及醛固酮在肢體創(chuàng)傷應(yīng)激后心肌損傷中的信號傳導(dǎo)機制及各信號通路之間的相互作用，同時研究H2S、CaN抑制劑FK506及醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯對心血管系統(tǒng)的保護作用。 本研究分為三部分：一、截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后心肌H2S/CSE體系和

4、CaN的動態(tài)變化及干預(yù)措施；二、截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后心肌損傷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究；三、截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后心肌損傷的線粒體機制。 方法：本實驗用手術(shù)的方法建立大鼠的左后肢截肢創(chuàng)傷應(yīng)激模型。第一部分實驗分組：雄性Wistar大鼠63只，隨機分為9組，每組7只：正常對照組；截肢后1h組；2h組；4h組；6h組；12h組；24h組；48h組；72h組。第二部分實驗分組：雄性Wistar大鼠42只，分為6組，每組7只：正常對照組；創(chuàng)傷對照組；Na

5、HS組：截肢后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；PPG組：截肢后立即給予腹腔注射PPG(50mg/kg)；FK506組：截肢后立即給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)；螺內(nèi)酯組：正常大鼠螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)，6天后截肢．觀察各組大鼠心肌病理、血漿H2S、NO、MPO、MDA、AngⅡ、ALD的變化，同時檢測各組大鼠心肌CSE活性，MPO、MDA、ALD的含量；并用RT-PCR的方法檢測心肌CaNmRNA的

6、表達，電鏡觀察心肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。第三部分實驗動物為48只雄性SD大鼠，隨機分為6組，每組8只：分組及處理同第二部分。觀察心肌線粒體呼吸功能和膜電位的變化，測定線粒體總ATP酶。 結(jié)果：第一部分結(jié)果：與正常對照組比較，血漿MPO、MDA在截肢后1h即有明顯升高，至截肢后6h達高峰，其后雖有所下降，但仍維持在較高水平。心肌MPO及MDA較血漿變化稍晚，于截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后2h開始升高，心肌MPO于12h最高，MDA于截肢后6h最

7、高。血漿H2S及NO均于創(chuàng)傷應(yīng)激后4h開始明顯下降，6h最低，至創(chuàng)傷后24h逐漸恢復(fù)。而心肌CSE酶活性的變化稍晚于血漿H2S，于創(chuàng)傷后12h最低，72h后才逐漸恢復(fù)。第二部分結(jié)果：與創(chuàng)傷對照組比，NaHs組及FK506組血漿及心肌MDA、ALD、H2S、NO含量增加，PPG組血漿MDA、ALD、H2S、NO及心肌CSE酶活性均下降，螺內(nèi)酯組血漿H2S、NO含量增加而心肌CSE酶活性變化不明顯。第三部分結(jié)果：與正常對照組比，創(chuàng)傷組線粒體

8、呼吸功能下降，RCR及P/O明顯降低，ATP酶含量及膜電位下降。與創(chuàng)傷組比較，NaHs組及FK506組心肌線粒體呼吸功能明顯改善，RCR、P/O及ATP酶含量增加，膜電位升高，而PPG組RCR、P/O及ATP酶含量減少。與創(chuàng)傷對照組比，螺內(nèi)酯組線粒體RCR，ATP及膜電位增加。 結(jié)論：截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后可以造成遠隔心肌及線粒體損傷，截肢創(chuàng)傷應(yīng)激后4～6小時，心肌損傷最重。炎細胞及炎性細胞因子的活化、過度的氧化應(yīng)激、CaN信號通路及內(nèi)