NECA誘導抗心肌-缺血再灌注損傷保護作用的線粒體機制研究.pdf

1、目的:
　　探討非選擇性腺苷受體激動劑5’-N-乙基酰胺基腺苷(5，-(N-ethylcarboxamid-o) adenosine，NECA)對缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）損傷心肌細胞的保護作用及其相關線粒體機制研究。
　　方法:
　　利用H9c2心肌細胞系建立模擬I/R損傷模型，采用CCK-8細胞活性測定試劑盒檢測細胞活性；通過線粒體膜電位檢測試劑盒（Mitochondrial

2、membrane potential assay kit with JC-1）檢測細胞線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△Ψm)；使用Amplex red過氧化氫/過氧化物酶試劑盒（Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit）測定細胞內(nèi)H2O2水平，活性氧檢測試劑盒（Reactive oxygen species assay kit w

3、ith DCFH-DA）檢測細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，Mitosox red線粒體超氧化物指示劑（Mitosox red mitochondrial superoxide indicator）檢測線粒體內(nèi)ROS水平；利用復合體I酶活性檢測試劑盒（Complex I enzyme activity assay kit）檢測線粒體呼吸鏈復合體 I的活性。
　　結果:
　　1.不同

4、濃度NECA（0.1、1、10μmol/L）對I/R后心肌細胞活性具有不同程度的保護作用(均P<0.05)，其中以1μmol/L時保護作用最為明顯，因此我們使用該濃度進行后續(xù)實驗；
　　2. I/R后細胞活性明顯降低，NECA可抑制I/R后細胞活性的下降，而腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261、腺苷A2B受體拮抗劑MRS1706單獨或聯(lián)合使用均可阻斷NECA對細胞的保護作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A2B

5、受體發(fā)揮其抗I/R損傷心肌保護作用；
　　3. I/R后細胞JC-1紅綠熒光強度比值明顯降低，說明I/R導致△Ψm的顯著降低，提示I/R導致線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的開放。NECA可抑制I/R后細胞△Ψm的改變，而腺苷A2A和A2B受體拮抗劑單獨或聯(lián)合使用均可抑制NECA對△Ψm的保護作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A

6、2B受體而發(fā)揮其抗I/R損傷心肌保護作用，其機制可能與抑制I/R損傷引起的mPTP的開放有關；
　　4. I/R損傷后細胞Amplex red、DCF、Mitosox red熒光強度均顯著增強，說明I/R使細胞以及線粒體ROS的含量增加。NECA可抑制I/R后細胞內(nèi)上述各熒光強度的增高，而腺苷A2A或A2B受體拮抗劑均可阻斷NECA的作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A2B受體來減少細胞及線粒體ROS的產(chǎn)生，

7、進而發(fā)揮其心肌保護作用；
　　5. NECA可降低I/R后線粒體復合體I的活性，而腺苷A2A或A2B受體拮抗劑均可逆轉NECA對I/R損傷后細胞內(nèi)線粒體復合體I活性的影響(均P<0.05)，提示NECA激活腺苷A2A和A2B受體后產(chǎn)生的心肌保護作用可能與抑制線粒體復合體I的活性有關；
　　6. Src酪氨酸激酶的選擇性抑制劑PP2可抑制NECA對I/R損傷后細胞活性的保護作用(P<0.05)，提示Src酪氨酸激酶可能介導NE

8、CA的心肌細胞保護；
　　7. Src酪氨酸激酶的選擇性抑制劑PP2可抑制NECA對I/R后細胞△Ψm的作用(P<0.05)，提示NECA抑制mPTP開放的作用可能與Src酪氨酸激酶的激活有關；
　　8.與NECA組相比，PP2+NECA組細胞Amplex red、DCF、Mitosox red熒光強度均顯著增強(均P<0.05)，提示NECA對I/R后細胞內(nèi)以及線粒體ROS增高的抑制作用可能與Src酪氨酸激酶的激活有關。<