非致命性創(chuàng)傷后心肌缺血-再灌注損傷加重的分子機(jī)制及脂聯(lián)素的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　非致命性創(chuàng)傷（如交通事故引起的機(jī)械損傷）一直是醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的重要課題。隨著醫(yī)療護(hù)理水平的提高，由創(chuàng)傷本身所引起的直接損傷危害逐年減少，而其繼發(fā)的創(chuàng)傷后臟器功能衰竭正日益受到重視。近年來多項(xiàng)臨床研究顯示，非致命性創(chuàng)傷后的患者在未發(fā)生冠脈夾層和直接心肌損傷的情況下，其心肌梗死（MI）和繼發(fā)性心功能不全的發(fā)病率均明顯增加，但其機(jī)制尚不清楚。
　　在對小鼠建立創(chuàng)傷性休克模型的研究中我們發(fā)現(xiàn)，可導(dǎo)致大鼠死亡的創(chuàng)傷強(qiáng)度

2、不能使小鼠出現(xiàn)全身臟器損傷。小鼠在創(chuàng)傷完全恢復(fù)后（創(chuàng)傷7天后）若發(fā)生心肌缺血，其損傷程度遠(yuǎn)重于未經(jīng)受創(chuàng)傷的動物。既往研究表明，創(chuàng)傷使全身循環(huán)中腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及其他炎性因子升高，但創(chuàng)傷后炎性因子的升高是一過性的，因此用TNF-α等炎性因子直接加重在創(chuàng)傷后遠(yuǎn)期出現(xiàn)的心肌缺血性損傷解釋不通，提示最大的可能性為：創(chuàng)傷后TNF-α等炎性因子升高誘發(fā)了機(jī)體的某種繼發(fā)反應(yīng)，而這種繼發(fā)反應(yīng)可能是導(dǎo)致創(chuàng)傷遠(yuǎn)期心肌出現(xiàn)缺血性損傷時損傷程度加

3、重的直接原因。但TNF-α等誘發(fā)了何種繼發(fā)性反應(yīng)因而加重缺血性損傷，目前仍是未解之謎。
　　脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。研究表明，血漿脂聯(lián)素水平與缺血性心肌病發(fā)病呈高度負(fù)相關(guān)，脂聯(lián)素可通過減輕氧化/硝化應(yīng)激等機(jī)制對心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷具有明確的保護(hù)作用?；A(chǔ)和臨床研究均已證實(shí)，TNF-α等炎性因子與脂聯(lián)素在一系列病理生理活動中具有相互拮抗關(guān)系。炎性因子的升高可抑制脂聯(lián)素分泌，降低血漿脂聯(lián)素水平。因此我們設(shè)想：非致命

4、性創(chuàng)傷所導(dǎo)致的TNF-α等一過性升高所致的繼發(fā)性脂聯(lián)素水平下降可能是創(chuàng)傷遠(yuǎn)期心肌缺血性損傷加重的重要原因。本研究擬對該假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)而闡明非致命創(chuàng)傷后心肌缺血性損傷加重的分子機(jī)制，為深入認(rèn)識創(chuàng)傷后所發(fā)生的病理改變、進(jìn)一步揭示創(chuàng)傷繼發(fā)的心肌缺血性損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究目的:
　　(1)觀察非致命性創(chuàng)傷對MI/R損傷嚴(yán)重程度（梗死面積、心功能和心肌細(xì)胞凋亡）的影響。
　　(2)明確創(chuàng)傷后血漿TNF-α的時相變

5、化及其對血漿脂聯(lián)素水平的調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　(3)觀察脂聯(lián)素水平變化對心肌氧化/硝化應(yīng)激及MI/R損傷嚴(yán)重程度的影響，進(jìn)一步闡明脂聯(lián)素水平變化在小鼠非致命性創(chuàng)傷后MI/R損傷加重中的作用及其分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　(1)小鼠創(chuàng)傷模型：用戊巴比妥鈉（40mg/kg,i.p.）麻醉雄性C57B16/J小鼠或脂聯(lián)素基因敲除小鼠（Adp-/-小鼠，20-25g）。將麻醉完全的小鼠置于Noble-Collip鼓中，以40rp

6、m的速率共200轉(zhuǎn)誘導(dǎo)全身非致命性創(chuàng)傷模型。假創(chuàng)傷小鼠采用同樣的轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)數(shù)，但小鼠用膠帶粘于鼓的內(nèi)壁上，因此避免了創(chuàng)傷。
　　(2)小鼠MI/R模型：用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支中點(diǎn)處打一活結(jié)造成心肌缺血，30min后,將活結(jié)打開行再灌注。再灌注3h后進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡及氧化/硝化應(yīng)激指標(biāo)檢測，再灌注24h后檢測心梗面積及心功能。假手術(shù)組采用同樣的方法處理，只是LAD不行結(jié)扎。
　　(3)心室插管檢測小鼠心功能：經(jīng)左側(cè)頸動脈

7、將1.4FMillar-tip導(dǎo)管換能器插入左室腔。用計(jì)算機(jī)算法和交互式視頻圖像程序（Po-Ne-MahPhysiologyPlatformP3Plus,GouldInstrumentSystems,Inc.）得出心率、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓最大上升速率的正值和負(fù)值（+dP/dtmax和-dP/dtmax）。
　　(4)心梗面積測定：伊文氏藍(lán)/三苯四唑氯鹽（TTC）雙染色法。
　　(5)心肌細(xì)胞凋亡檢測：①末端脫

8、氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法；②Caspase-3活性測定。
　　(6)血漿TNF-α及脂聯(lián)素水平：采用ELISA檢測。
　　(7)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)：采用WesternBlot檢測。
　　(8)一氧化氮（NO）及其在體代謝產(chǎn)物（NO2和NO3），統(tǒng)稱為NOx，采用硝酸還原酶法檢測。
　　(9)?O2￣生成采用熒光素增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法和原位二氫乙啶（DHE）染色法檢測。<

9、br>　　(10)心肌ONOO-水平：采用競爭ELISA法檢測及免疫組織化學(xué)方法檢測。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)與假創(chuàng)傷+MI/R組（假創(chuàng)傷7d后行MI/R）相比，創(chuàng)傷+MI/R組（創(chuàng)傷7d后行MI/R）小鼠的心梗面積增加（P<0.05）、LVEDP進(jìn)一步增大（P<0.01）而±dP/dtmax進(jìn)一步減小（P<0.05）、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）及caspase-3活性進(jìn)一步增加（P<0.01）。
　　(2)創(chuàng)傷后3

10、h血漿TNF-α達(dá)到峰值（P<0.01vs.0時間點(diǎn)組），此后迅速降低，未再出現(xiàn)第二個峰值。創(chuàng)傷后血漿脂聯(lián)素水平逐漸下降，至創(chuàng)傷后3d達(dá)到谷值（P<0.01vs.0時間點(diǎn)組），之后較快恢復(fù)到正常水平。在創(chuàng)傷前給予TNF-α抑制劑etanercept（創(chuàng)傷前16h和1h，8mg/kg×2）可阻斷脂聯(lián)素水平的時相變化。
　　(3)用etanercept抑制TNF-α可減輕創(chuàng)傷7d后MI/R所造成的心肌梗死、心功能下降及心肌細(xì)胞凋亡。再

11、灌注前10min給予小鼠腹腔注射脂聯(lián)素球狀片段（gAd，0.5mg/kg）或在創(chuàng)傷3d后給予gAd也可明顯抑制MI/R所造成的心肌損傷。
　　(4)創(chuàng)傷可使MI/R后心肌?O2￣生成增加～1.6倍（P<0.01vs.假創(chuàng)傷）。在創(chuàng)傷前用etanercept抑制TNF-α、或再灌注前10min給予gAd，或在創(chuàng)傷3d后給予gAd均可使MI/R后心肌?O2￣生成顯著減少（P<0.01～0.05vs.假創(chuàng)傷）。
　　(5)創(chuàng)傷可使

12、MI/R后心肌iNOS表達(dá)增強(qiáng)，NOx的生成增加（～1.5倍，P<0.05vs.假創(chuàng)傷）。在創(chuàng)傷前用etanercept抑制TNF-α、創(chuàng)傷3d后或創(chuàng)傷7d后再灌注前10min給小鼠腹腔注射gAd均可使MI/R后心肌NOx生成顯著減少（P<0.01～0.05vs.假創(chuàng)傷）。
　　(6)創(chuàng)傷+MI/R組小鼠心肌過氧化亞硝酸鹽免疫組化信號增強(qiáng)，ONOO-生成顯著增加（～5倍，P<0.05vs.假創(chuàng)傷+MI/R組）。在創(chuàng)傷前用etane

13、rcept抑制TNF-α、創(chuàng)傷3d后或創(chuàng)傷7d后再灌注前10min給小鼠腹腔注射gAd均可使MI/R后心肌過氧化亞硝酸鹽免疫組化信號減弱及ONOO-生成明顯減少（P<0.01～0.05vs.假創(chuàng)傷）。
　　(7)在再灌注前10min給予Mn(III)TBAP（?O2￣清除劑，10mg/kg）或EUK134（ONOO-清除劑，5mg/kg）可縮小創(chuàng)傷+MI/R后的心梗面積、改善心功能，同時抑制心肌細(xì)胞凋亡及caspase-3激活。<

14、br>　　(8)Etanercept僅可輕度縮小創(chuàng)傷+MI/R誘導(dǎo)的Adp-/-小鼠心梗面積（12.4％，P=0.046vs.vehicle），而補(bǔ)充外源性gAd可縮小創(chuàng)傷+MI/R誘導(dǎo)的心梗面積達(dá)37.8％（P<0.01vs.vehicle）。但etanercept不能改善創(chuàng)傷+MI/R組Adp-/-小鼠的±dp/dtmax降低（P>0.05vs.vehicle），只有補(bǔ)充外源性gAd對其具有改善作用（P<0.01vs.vehicle

15、）。
　　結(jié)論:
　　(1)非致命性創(chuàng)傷可使小鼠MI/R損傷加重，創(chuàng)傷可能是心肌缺血性損傷加重的“隱性殺手”。
　　(2)創(chuàng)傷后血漿TNF-α升高可繼發(fā)性抑制脂聯(lián)素水平。抑制TNF-α或直接補(bǔ)充脂聯(lián)素（gAd）可減輕創(chuàng)傷對MI/R損傷的增敏作用，提示TNF-α誘導(dǎo)的脂聯(lián)素減少很有可能參與創(chuàng)傷后MI/R損傷加重。
　　(3)創(chuàng)傷后TNF-α升高可通過降低脂聯(lián)素水平導(dǎo)致MI/R后心肌氧化/硝化應(yīng)激增加，進(jìn)而增加心肌對