全肝缺血再灌注后心肌及線粒體損傷的機(jī)制及防護(hù).pdf

1、背景與目的：肝臟移植術(shù)，肝臟大部切除術(shù)臨床上極為常見，手術(shù)技術(shù)相當(dāng)成熟，但術(shù)中需要阻斷下腔靜脈，門靜脈及肝動脈的血流，手術(shù)過程復(fù)雜，造成全肝缺血再灌注損傷，不僅影響肝臟本身功能，對遠(yuǎn)隔臟器-心臟也會造成損傷，全肝缺血再灌注引起心臟損傷的的病理生理機(jī)制，至今尚未完全闡明。
　　 本實(shí)驗(yàn)用手術(shù)的方法建立大鼠的全肝缺血再灌注模型，動態(tài)檢測血漿H2S、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、丙二醛(m

2、alondialdehyde，MDA)、血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)、醛固酮(aldosterone，ALD)及血清心肌肌酸激酶同功酶(MB isoenzyme ofcreatine kinase，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的變化，檢測心肌CSE活性及ALD、NF-kB含量，并用RT-PCR的方法檢測心肌CaNmRNA及ALDH2mRNA的表達(dá)，觀察心肌

3、組織CaN Aβ基因及ALDH2基因表達(dá)的變化，同時(shí)光鏡下觀察心肌的病理損傷，電鏡觀察心肌線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。并應(yīng)用H2S供體NaHS、CaN抑制劑FK506、醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯及激素甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone，MP)進(jìn)行干預(yù)，觀察上述指標(biāo)及線粒體琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性、Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase的活性變化，進(jìn)一步研究H2S、CaN、

4、醛固酮及激素在全肝缺血再灌注心肌損傷中的信號傳導(dǎo)機(jī)制及各信號通路之間的相互作用，同時(shí)研究H2S、CaN抑制劑FK506、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯及激素對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。
　　 本研究分為三部分：
　　 一、全肝缺血再灌注心肌損傷的機(jī)理研究；
　　 二、全肝缺血再灌注后心肌損傷的保護(hù)及其保護(hù)機(jī)理研究；
　　 三、全肝缺血再灌注后心肌損傷的線粒體機(jī)制及其干預(yù)研究。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)用手術(shù)的方法建

5、立大鼠的全肝缺血再灌注模型。
　　 第一部分:實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠88只，隨機(jī)分為11組，每組8只：正常對照組；缺血20min組；缺血40min組；缺血20min再灌注2h組；缺血20min再灌注6h組；缺血20min再灌注12h組；缺血20min再灌注24h組；缺血20min再灌注48h組；缺血20min再灌注72h組；缺血40min再灌注6h組；缺血40min再灌注72h組。
　　 第二部分:實(shí)驗(yàn)分組：雄性

6、Wistar大鼠128只，隨機(jī)分為16組，每組8只：正常對照組；缺血20min再灌注6h組；缺血40min再灌注6h組；缺血40min再灌注72h組；缺血20minFK506組：再通后立即給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)；缺血20min NaHS組：再通后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；缺血20min MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；缺血20min螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)

7、，6天后手術(shù)：FK506組：假手術(shù)后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)；NaHS組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；MP組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)持續(xù)6天后假手術(shù)；缺血40 min再灌注6h MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)，再灌后6h處死：缺血40 min再灌注6h螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術(shù)前6天每天灌胃(20mg/kg)，

8、再灌注后6h處死；缺血40 min再灌注72h MP組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)，再灌后72h處死；缺血40 min再灌注72h螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術(shù)前6天每天灌胃(20mg/kg)，再灌后72h處死.再通后觀察各組大鼠心肌病理、血漿H2S、MDA、Ang II、ALD、TNF-α的變化，血清CK-MB、LDH的變化，同時(shí)檢測各組大鼠心肌CSE活性、ALD、NF-kB含量；并用RT-PCR的方法檢測心肌CaN mRNA、

9、ALDH2 mRNA的表達(dá)。
　　 第三部分:實(shí)驗(yàn)動物為80只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為10組，每組8只：正常對照組；缺血20min再灌注6h組；FK506組：假手術(shù)后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)； NaHS組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；MP組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)持續(xù)6天后假手術(shù)；FK506干預(yù)組：再通后立即給

10、予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)：NaHS干預(yù)組：再通后立即給予腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；缺血20min MP干預(yù)組：再通后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)；缺血20min螺內(nèi)酯干預(yù)組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)，6天后手術(shù)。觀察心肌線粒體膜電位、呼吸功能、SDH活性、Ca2+-ATPase及Na+/K+-ATPase的活性變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分結(jié)果：與正常對照組比較，血漿

11、MDA、血清TNF-α在缺血20min即有明顯升高，再灌注后6h達(dá)高峰，其后雖有所下降，但仍維持在較高水平.血漿H2S于缺血20min開始明顯下降，再灌注后2h開始升高，6h達(dá)最高峰，至再灌注后72h逐漸恢復(fù)。而心肌CSE酶活性的變化稍晚于血漿H2S，于創(chuàng)傷后12h最低，72h后才逐漸恢復(fù)，
　　 第二部分結(jié)果：與全肝缺血再灌注組比，四種干預(yù)藥物血MDA、TNF-α、心肌NF-kB、ICAM-1含量均降低，NaHS組血漿H2S含

12、量增加，余藥物干預(yù)組血漿H2S含量減低，螺內(nèi)酯組與FK506組心肌CSE酶變化不明顯，余藥物干預(yù)組下降.
　　 第三部分結(jié)果：與正常對照組比，缺血20min再灌注6h組線粒體呼吸功能下降，RCR及P/O明顯降低，Na+/K+ATP酶，SDH酶及膜電位下降，Ca2+-ATP酶含量升高，與缺血20min再灌注6h組比較，NaHS組、FK506組、MP組心肌線粒體呼吸功能明顯改善，RCR、P/O及Na+/K+ ATP酶，SDH酶含量增

13、加，Ca2+- ATP酶含量升高，膜電位升高。與缺血20min再灌注6h組組比，螺內(nèi)酯組線粒體RCR、Na+/K+-ATP酶、SDH酶及膜電位增加，Ca2+-ATP酶減少。
　　 結(jié)論：全肝缺血再灌注后可以造成遠(yuǎn)隔的心臟及線粒體損傷，全肝缺血再灌注后2～6小時(shí)，心肌損傷最重。炎細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子的活化、過度的氧化應(yīng)激、CaN信號通路及內(nèi)源性血漿H2S/心肌CSE體系均參與了全肝缺血再灌注后心肌損傷。外源性H2S補(bǔ)充及CaN抑制劑