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1、目的:本文旨在觀察癌性微環(huán)境下肝星狀細(xì)胞(HSC)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素低親合力受體p75(P75ntr)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素高親合力受體酪氨酸激酶A(TrkA)的表達(dá)狀況及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)HSC兩種受體表達(dá)及細(xì)胞生存狀態(tài)的影響,為深入了解肝癌細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:⑴MTT法檢測(cè)不同時(shí)間、不同濃度肝癌細(xì)胞(HepG2)上清液作為條件培養(yǎng)基(取12h、24h、48h的條件培養(yǎng)基分別按1∶8、1∶4、1∶2的比例用
2、無血清DMEM稀釋)對(duì)HSC增殖的影響,取促增殖作用最強(qiáng)的一組條件培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)用條件培養(yǎng)基。⑵流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與不同濃度NGF(1、10、100μg/L)共同作用下HSC的細(xì)胞周期和凋亡率變化。⑶免疫組織化學(xué)(IHC)半定量檢測(cè)單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與不同濃度NGF共同作用下HSC的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、P75
3、ntr、TrkA的蛋白表達(dá),用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)半定量分析。⑷透射電鏡(TEM)觀察單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與NGF共同作用下HSC的超微結(jié)構(gòu)改變。
結(jié)果:①M(fèi)TT結(jié)果顯示:48h的肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基在1∶2濃度時(shí)對(duì)HSC的促增殖作用最強(qiáng)。②FCM結(jié)果顯示:與單純培養(yǎng)的HSC相比,肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用的HSC增殖指數(shù)升高,凋亡無明顯變化;肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與NGF共同作用于HSC后
4、,隨著NGF濃度的增加,細(xì)胞凋亡率增加,但對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。③免疫組化結(jié)果顯示:α-SMA、P75NTR、TrkA在各組的HSC中均有表達(dá)。與單純培養(yǎng)組相比,肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基組的HSC表達(dá)α-SMA、P75NTR、TrkA均有不同程度的增加,在肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入NGF后,HSC表達(dá)α-SMA、P75NTR有隨NGF濃度增加而增加的趨勢(shì),而表達(dá)TrkA有隨NGF濃度增加而減少的趨勢(shì)。④透射電鏡結(jié)果顯示:?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的HSC細(xì)胞形態(tài)
5、完整,極少見凋亡細(xì)胞。肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用的HSC,可見細(xì)胞增殖活躍,易見核分裂象,凋亡不明顯。在肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入NGF后,HSC凋亡數(shù)目隨NGF濃度的增加而增多,并可見不同時(shí)期的凋亡細(xì)胞。
結(jié)論:?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)的HSC表達(dá)P75ntr和TrkA。HSC經(jīng)肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用后,其P75ntr、TrkA的表達(dá)均增強(qiáng)。但在條件培養(yǎng)基中加入NGF后,HSC的P75ntr表達(dá)增強(qiáng)、TrkA表達(dá)減弱,細(xì)胞凋亡增加。提示在癌性
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