靶向P75NTR的siRNA技術(shù)誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、分類號(hào)：R6511密級(jí)：學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位一專業(yè)學(xué)位口O學(xué)校代碼：10062學(xué)號(hào)：20n702333學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)又坪眚科袁號(hào)碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATIoN論文題目：靶向P75NTR的siRNA技術(shù)誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究TITLEAnexperimentalstudyofsiRNAtargetingP75NTRtoinduceapoptosisofU251gliomacells一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)

2、科：外科學(xué)神外論文作者：張?zhí)┲笇?dǎo)教師：亢建民天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一四年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要【目的】膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。盡管成像技術(shù)和多模式的治療方案有了長足發(fā)展，但總的來說，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后很不樂觀。即使給予最為充分的治療，患者的平均存活期中位數(shù)只有1218周，而那些沒有進(jìn)行干預(yù)治療的患者多在診斷后不久死亡。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后不良主要是由于極高的復(fù)發(fā)傾向。有人認(rèn)為，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在生存到32～

3、36周復(fù)發(fā)幾乎不可避免。P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(P75neurotrophirtreceptor，P75NTR)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖，抑制凋亡的相關(guān)基因。本研究利用RNA干擾(RNAinterfere，RNAi)技術(shù)沉默P75N1R在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系U251中的表達(dá)，觀察其促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的治療效果，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療提供新的方法選擇。【方法】①U25l膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，每3

4、d傳代1次。取生長狀態(tài)良好的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前24h換液備用。實(shí)驗(yàn)共分為5組。對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞；空載組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞；siRNA1～3組：分別轉(zhuǎn)染序列(1)～(3)的U25l膠質(zhì)瘤細(xì)胞。②RTPCR方法檢測(cè)P75N1R的mRNA表達(dá)以確定基因沉默效果：利用PrimerPremier50軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物，P75mR引物序列為：上游5’一CGTATTCCGACGAGGCCAACC一3’，下游5

5、’一CCAC從GGCCGAC從CCACAGG一3’，產(chǎn)物大小為286bp：GAPDH引物序列為：上游5’一CGGAGTCAACGGATTTGGTAT一3’，下游5’一AGccTTcTCcATGGTGGTG從GAc一3’，產(chǎn)物大小為598bp。③繪制細(xì)胞生長曲線：將獲得最佳基因沉默效果的穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞作為RNAi組置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第24、48、72、96、120、144h行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。④原位細(xì)胞凋亡

6、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況⑤Westernblot方法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后第3天時(shí)P75mR、促凋亡基因Caspase一3和凋亡抑制基因BcI2的蛋白表達(dá)?！窘Y(jié)果】①RTPCR檢測(cè)結(jié)果空載組及對(duì)照組U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均高表達(dá)P75NTRmRNA，轉(zhuǎn)染P75NTRsiRNA質(zhì)粒后U251細(xì)胞P75NrR的mRNA表達(dá)水平顯著下降。②細(xì)胞生長曲線對(duì)照組和空載組細(xì)胞增殖旺盛，RNAi組細(xì)胞增殖速度在幾個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于對(duì)照組和空載組，即細(xì)胞增殖能力