植物疫害生物分子檢驗檢疫技術研究與固相化檢測試劑盒研制.pdf

1、本博士論文針對國內外植物疫害生物急需相應檢疫檢驗技術體系和快速檢測試劑（盒）的現(xiàn)狀，選擇嚴重影響農業(yè)生產安全的柑桔潰瘍病菌、亞洲柑桔韌皮部桿菌、小麥矮腥黑穗菌和馬鈴薯種傳病毒等為靶標疫害微生物，依據(jù)專有基因序列設計特異性引物/探針，利用簡易快速、高效排抑的膜分離樣品制備方法，建立了靶標疫害微生物特異、準確的免疫診斷和PCR檢驗檢疫技術體系，并基于獨創(chuàng)的生物大分子穩(wěn)定劑創(chuàng)制新型固相化分子診斷試劑盒，并用于近緣種類的甄別、田間病害早期診斷和

2、疫情動態(tài)監(jiān)測。對于增強我國防范農業(yè)植物外來疫害入侵和擴散的檢疫監(jiān)控能力，提高我國農業(yè)植物疫害生物檢驗檢疫技術整體水平，確保中國農產品的安全生產，促進中國農產品順利出口具有重要意義。 (1) 柑桔潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv. Citri, Xac）引起的柑桔潰瘍病是嚴重影響全世界柑桔生產的重大檢疫性病害。本研究選擇Xac獨有蛋白基因序列分別設計篩選出特異性引物對(JYF5/JYR5)，建立了柑桔潰

3、瘍病菌常規(guī)PCR檢測技術，經反復測試結果表明能夠穩(wěn)定地特異性檢出柑桔組織表面所帶潰瘍病菌的DNA靶帶(413 bp)。而對柑桔葉面附生的非致病性黃單胞菌、野油菜黃單胞菌等近緣種以及健康柑桔樣品都不能擴增出該靶帶；靶細菌DNA檢測下限為1.56 pg/μL，細菌懸浮液檢測下限為10 cfu/μL；在不同PCR儀及各種控溫方式下都能穩(wěn)定地擴增出特征性靶帶，說明該檢測技術已經成熟穩(wěn)定。以插入Xac靶序列片段的重組質粒DNA或潰瘍病菌菌液或顯癥

4、材料作為陽性對照樣品，以盆栽柑桔實生苗作為陰性對照樣品，利用建立的PCR技術和固相化檢測試劑盒對南方柑桔主產區(qū)的柑桔葉片、枝條和果實樣品統(tǒng)一制樣進行了實際檢測，結果與各地實際病害發(fā)生一致。 (2) 柑桔黃龍?。–itrus Huanglongbing, HLB）由難以人工培養(yǎng)的韌皮部桿狀細菌所引起，是嚴重影響世界柑桔產業(yè)的重要檢疫性細菌病害之一。該病可以通過罹病接穗嫁接、帶菌柑桔木虱（Diaphorina citri）取食健株新

5、梢以及罹病柑桔種苗遠距離傳播。利用克隆測序的16S rDNA核糖體蛋白基因序列片段比對分析，設計靶序列特異引物對和熒光探針，建立并優(yōu)化了柑桔黃龍病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus）的常規(guī)PCR、熒光染料和TaqMan探針定量PCR反應體系，分別測評了檢測特異性、靈敏度以及準確度，結果表明TaqMan探針PCR對于靶標病原菌的檢測特異性最強，但檢測成本較高；SYBR Green I 染料法的檢測靈敏度

6、最高，常規(guī)PCR、TaqMan探針法、SYBR Green I 染料法對靶片段序列DNA的檢測下限依次為43.90 fg/μl、4.39 fg/μl、0.44 fg/μl，定量PCR檢測靈敏度較常規(guī)PCR高出至少1－2個數(shù)量級。對來自6省市果園送檢的顯癥或無癥柑桔組織樣品進行實際檢測，結果表明基于特異引物對的常規(guī)PCR和TaqMan探針的實時熒光定量PCR，都可以快速準確地檢出疫害生物的靶標序列片段，TaqMan探針法檢出率更高。

7、 (3) 小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kühn, TCK）引起的小麥矮腥黑穗?。╓heat dwarf bunt disease），是麥類腥黑穗病中危害最大、極難防治的國內外檢疫性病害之一。TCK與其近緣種小麥網腥黑穗病菌(Tilletia caries Tul，TCT）在冬孢子形態(tài)學、ITS基因水平上都具有很高的同源性，國內外利用18S rDNA的轉錄間區(qū)序列分析、隨機多態(tài)性DAN 擴增、Rep-PC

8、R、基因指紋圖譜等方法尋找TCK種內及種間差異的努力，一直未能成功。 本博士論文采用RAPD引物介導的半特異性PCR法（RAPD primer mediated semi-specific PCR, RM-PCR）篩選TCK的端粒相關序列。根據(jù)端粒DNA（Telomere sequence）保守重復序列TTAGGG和端粒相關序列（Telomere associated-sequence, TAS）的高度多態(tài)性特點，將帶有錨定堿基

9、的端粒特異性引物（5’CCCTAACCCTAACCCWAA 3’）和RAPD隨機引物結合，擴增端粒相關序列（TAS）。采用不對稱復性溫度PCR方法，高嚴謹循環(huán)和低嚴謹循環(huán)交替進行，使端粒重復序列特異引物擴增的特異性產物產量遠遠超過RAPD單引物擴增的非特異性產物。通過變換隨機單引物，篩選出TCK與TCT不同的端粒相關序列，并將篩選的4個特異性端粒相關序列克隆測序，經與國際上三大基因文庫BLASTn聯(lián)網比對分析序列同源性，選出與其他已知真

10、菌的同源性都很低的TCK特征性差異序列片段（1322bp），并據(jù)此設計兩對特異引物CQUTCK1/CQUTCK2和CQUTCK3/CQUTCK4，分別以制備的TCK和TCT的冬孢子或菌絲體DNA為模板，采用降落PCR（Touch down PCR, TD-PCR）擴增驗證了引物特異性，結果表明，在供試TCK所有菌株中，兩對引物均能擴增出預期的目標DNA譜帶，而TCT菌株中則無相同的DNA擴增產物，證實靶標片段確為TCK的特異基因序列片段

11、，引物對具有很高的特異性，可用于TCK和TCT分子水平的快速鑒定。本研究成果解決了?；訲CK分子檢疫檢驗技術體系的建立和檢測試劑盒的研制中的關鍵技術難題。已獲準登陸NCBI基因文庫（GenBank，Accession No: DQ266258）。 (4) 引致馬鈴薯品種退化、產量下降的PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS以及PSTVd等多種病毒是我國馬鈴薯產區(qū)的主要有害生物，工廠化組培馬鈴薯種苗和各級種薯品質的檢定和田間復

12、合侵染馬鈴薯病害的種類鑒定都需要快速準確的分子檢驗技術。利用篩選的Triton X-100和Na2SO3 病毒釋放劑，直接從組織中提取馬鈴薯ssRNA病毒的簡易浸提法，優(yōu)化反轉錄靶標病毒下游引物比例、PCR擴增的復性溫度、Mg2＋和dNTPs濃度的基礎上，建立了比一步法靈敏度更高而且穩(wěn)定的兩步法多重RT-PCR檢測體系，該檢測體系同DSA－ELISA相比靈敏度高約100倍。研制了兩步法多重RT-PCR固相化檢測試劑盒。采用多重RT-PC

13、R檢測試劑盒對來自四川、重慶等15縣市248個苗圃與大田的顯癥或無癥馬鈴薯種薯（苗）樣品實際檢測，都能正確檢測出植株所帶病毒。為馬鈴薯病毒病快速鑒定和田間病害早期診斷提供了分子檢測技術和實用工具，適合于省級植保部門和脫毒種薯育苗單位以及科研部門推廣使用。 (5) 病害分子檢測中，陽性對照的缺乏和不準確是影響檢測標準化和準確性的重要因素。同時使用活體微生物作為陽性對照還存在有害生物擴散的危險，加熱滅活的菌液因保存期限短，不宜作為陽

14、性對照。本研究將以特異性引物擴增的DNA片段克隆測序，確認特異性后經克隆轉化，建立了疫害生物的重組質粒DNA陽性參照品，為病害檢測標準化提供了技術支撐，確保檢測的準確性和可比性，避免了檢測過程中檢疫性有害生物在環(huán)境中的二次擴散。 (6) 基于上述靶標疫害生物的特異性引物/探針，優(yōu)化的相應分子檢測方法、反應條件和試劑配方，加入專有的生物活性分子穩(wěn)定劑經過預混分裝，預凍后經真空冷凍干燥后制成固相化檢測試劑盒。經反復測試表明固相化試劑

15、盒可以在常溫條件下密封保存至少半年,檢測穩(wěn)定性、靈敏度和特異性等各項技術指標均無明顯改變。試劑盒即開即用，操作簡單，利于檢測標準化，適用于大量樣品的檢測。目前已研制出的系列固相化試劑盒包括柑桔潰瘍病菌、柑桔黃龍病菌小麥矮腥黒穗菌的PCR固相化檢測試劑盒；SGI熒光染料和TaqMan水解探針定量PCR固相化檢測試劑盒；馬鈴薯病毒多重－RT－PCR檢測試劑盒。已經用于國內外相關疫害生物各種送檢或采集樣品的實際檢驗檢疫。已申報4項檢測技術與固