ADMA代謝酶基因多態(tài)性與中國漢族人群動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病易感性及機(jī)制研究.pdf

1、第一章:ADMA代謝酶基因多態(tài)性與中國漢族人群冠心病易感性的關(guān)聯(lián)研究研究背景:
　　冠心病（Coronary heart disease，CHD）是最主要的心血管疾病，也是造成死亡的主要疾病之一。冠心病的風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳因素和環(huán)境因素兩個(gè)方面。
　　動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是冠心病發(fā)生的最根本病理改變。非對(duì)稱二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）一種內(nèi)源性

2、一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）抑制劑，通過抑制NO的合成，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。同時(shí)，ADMA通過抑制NO的生物合成和促進(jìn)炎癥過程，在動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　人體內(nèi)大部分ADMA經(jīng)ADMA代謝酶代謝滅活，ADMA代謝酶主要包括二甲基精氨酸二甲胺水解酶1（Dimethylargininedimethylaminohydrolase1，DDAH1）和丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2（Alanine-g

3、lyoxylate aminotransferase2，AGXT2）代謝滅活。研究表明，ADMA滅活酶基因多態(tài)性與心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)易感性和血漿中ADMA水平均相關(guān)，本研究的目的旨在闡明DDAH1和AGXT2基因多態(tài)性是否與中國漢族人冠心病易感性相關(guān)，同時(shí)探究這兩個(gè)基因多態(tài)對(duì)血漿中ADMA的影響，為CHD尋找新的易感位點(diǎn)和新的防治策略。
　　方法:
　　1.病例對(duì)照研究DDAH

4、1和AGXT2基因多態(tài)性與CHD易感性的關(guān)系收集1103例正常對(duì)照和942例CHD患者血液標(biāo)本，提取基因組DNA。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）的分析方法，對(duì)正常對(duì)照組和CHD樣本進(jìn)行AGXT2 rs37369和DDAH1rs233113位點(diǎn)基因分型。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和Logistic回歸分析基因型與CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
　　2.DDAH1和AGXT2基因多態(tài)性對(duì)健康志愿者血漿中ADMA水平影響利用酶聯(lián)

5、免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法測(cè)定311例健康志愿者血漿中ADMA濃度。單因素方差分析(One-way ANOVA)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析DDAH1和AGXT2基因型與血漿中ADMA水平間關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.Logistic回歸分析對(duì)CHD潛在混雜因素進(jìn)行校正后發(fā)現(xiàn)，DDAH1rs233113 AT基因型和T等位(AT+TT)可以顯著降低總?cè)巳褐蠧H

6、D的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.79，95％ CI:0.65-0.95，P=0.013和OR=0.82，95％ CI:0.69-0.98，P=0.028）;在非吸煙人群中，rs233113 AT基因型（OR=0.73，95％ CI:0.58-0.92，P=0.009）和T等位(OR=0.78，95％ CI:0.63-0.98，P=0.030)可以顯著降低CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);對(duì)糖尿病進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，AT基因型(OR=0.77，95％ CI:0.6

7、3-0.94,P=0.011)和T等位（OR=0.79,95％ CI:0.65-0.96,P=0.015）可降低無糖尿病個(gè)體CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)AT基因型(OR=0.73,95％ CI:0.56-0.93,P=0.013)和T等位(OR=0.76,95％ CI:0.60-0.96，P=0.023)可以顯著降低不吸煙人群中無糖尿病個(gè)體CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.CHD患者中AGXT2 rs37369 GG基因型的頻率顯著高于對(duì)照組(

8、18.5％ vs14.8％，P=0.025);與rs37369 A(AA+AG)基因型相比，rs37369 GG基因型可顯著升高吸煙人群中CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.21，95％ CI:1.24-3.92，P=0.007)，以及顯著升高吸煙且同時(shí)患有糖尿病個(gè)體的CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.32，95％ CI:1.14-9.67，P=0.028)。
　　3.在吸煙個(gè)體中，DDAH1 rs233113 AT基因型個(gè)體血漿中ADMA水平顯

9、著高于其它兩種基因型(P=0.038和P=0.036);在不吸煙人群中，AGXT2 rs37369 GG基因型個(gè)體血漿中ADMA水平顯著低于A等位(AA+AG)攜帶者（0.45±0.05μM，n=43 vs0.65±0.04μM，n=184，P=0.003），但是在吸煙人群中rs37369 GG基因型個(gè)體血漿中ADMA水平顯著高于rs37369 A等位基因攜帶者(0.92±0.16μM，n=14 vs0.51±0.05μM，n=70，P

10、=0.004)，吸煙人群中AGXT2rs37369 GG基因型個(gè)體血漿ADMA水平也是顯著高于不吸煙人群 rs37369 GG基因型個(gè)體(P=0.012)。
　　4.攜帶DDAH1 rs233113和AGXT2 rs37369兩個(gè)SNP位點(diǎn)任一風(fēng)險(xiǎn)基因型均可顯著升高冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且健康對(duì)照吸煙個(gè)體中同時(shí)攜帶兩個(gè)SNP位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型的血漿中ADMA水平顯著升高(P=0.003)。
　　結(jié)論:
　　1.DDAH1 rs

11、233113多態(tài)可降低中國漢族人群冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其可以降低不吸煙和不伴糖尿病的個(gè)體冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.AGXT2 rs37369多態(tài)可顯著升高中國漢族吸煙人群冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其可升高吸煙且同時(shí)伴有糖尿病的個(gè)體冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其機(jī)制可能與吸煙狀態(tài)下血漿中ADMA水平升高有關(guān)。
　　3.DDAH1 rs233113和AGXT2 rs37369多態(tài)性之間存在聯(lián)合作用，共同影響中國漢族人群冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

12、>　　第二章:ADMA代謝酶基因多態(tài)性與中國漢族人群缺血性腦卒中易感性和預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究研究背景:
　　腦卒中（Stroke）是全世界范圍內(nèi)最主要的致殘?jiān)?，在所有死因中位居第二，缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的60％～80％。我國人群腦卒中發(fā)病率和患病率總體呈上升趨勢(shì)，并且其致殘率和致死率較高，是嚴(yán)重危害我國老年人健康與生命的主要疾病。IS病因也包括環(huán)境因素和遺傳因素。

13、>　　頸動(dòng)脈粥樣硬化是IS最重要的病因和危險(xiǎn)因素，它與梗塞的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)以及梗死的部位密切相關(guān)。非對(duì)稱二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）通過抑制一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)活性抑制NO的合成，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。ADMA造成的內(nèi)皮功能紊亂是動(dòng)脈硬化發(fā)生的起始步驟。
　　人體內(nèi)絕大部分ADMA由二甲基精氨酸二甲胺水解酶1（Dimethylarg

14、inine dimethylaminohydrolase1，DDAH1）和丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2（Alanine-glyoxylate aminotransferase2，AGXT2）代謝滅活，研究表明ADMA代謝酶基因多態(tài)性與循環(huán)中ADMA水平相關(guān)。本研目的旨在探討AGXT2和DDAH1基因的遺傳多態(tài)性是否與IS易感性和預(yù)后相關(guān)，為IS尋找新的易感位點(diǎn)和新的防治策略。
　　方法:
　　1.病例對(duì)照研究AGXT2和DDAH1基

15、因多態(tài)性與IS易感性的關(guān)系收集1103例正常對(duì)照和1012例IS患者血液標(biāo)本，提取基因組DNA。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對(duì)正常對(duì)照組和IS樣本進(jìn)行AGXT2 rs37369、DDAH1 rs233113和rs233112位點(diǎn)的基因分型。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和Logistic回歸分析基因型與IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
　　2.AGXT2和DDAH1基因多態(tài)性與IS預(yù)后關(guān)系對(duì)部分IS患者進(jìn)行電話隨訪，詳細(xì)記

16、錄患者是否有事件發(fā)生（包括是否死亡、是否復(fù)發(fā)腦梗塞和心梗梗塞），事件發(fā)生時(shí)間等信息，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和Kaplan-Meier分析AGXT2和DDAH1基因多態(tài)性對(duì)IS患者預(yù)后的影響。
　　結(jié)果:
　　1.AGXT2 rs37369 GG基因型和A等位（AA+AG）分布在病例組和對(duì)種組分布無顯著差異(P=0.163)，同時(shí)與IS易感性也不相關(guān)，。
　　2.DDAH1 rs233113與總?cè)巳?、吸煙人群和不吸煙人群中IS易感

17、性不相關(guān)。以高血壓和糖尿病分層分析發(fā)現(xiàn)，與rs233113 AA基因型相比，AT基因型可以顯著降低糖尿病患者IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.73，95％ CI=0.53-0.99, P=0.046)。
　　3.對(duì)照組中DDAH1 rs233112 G等位基因(AG+GG)頻率顯著高于病例組（71.6％ vs66.7％，P=0.020）。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，與rs233112 AA基因型個(gè)體相比，總?cè)巳褐蠥G基因型和GG基因型個(gè)體

18、以及G等位(AG+GG)攜帶者IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均顯著降低(OR=0.78,95％CI=0.63-0.96,P=0.019; OR=0.76,95％CI=0.58-0.99, P=0.045和OR=0.77,95％ CI=0.63-0.94, P=0.011);rs233112 AG基因型、GG基因型和G等位攜帶(AG+GG)還可顯著降低高血壓個(gè)體IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.73，95％ CI=0.57-0.92，P=0.007; OR=0.

19、71,95％ CI=0.52-0.96, P=0.026和OR=0.72,95％CI=0.58-0.90，P=0.003）;同時(shí)rs233112 AG基因型和G等位（AG+GG）可以顯著降低糖尿病患者IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.59，95％ CI=0.42-0.84,P=0.003和OR=0.65,95％ CI=0.47-0.90,P=0.010)。
　　4.與同時(shí)攜帶DDAH1 rs233113和rs233112保護(hù)基因型個(gè)體比，

20、同時(shí)攜帶兩個(gè)位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)基因型（rs233113AA，rs233112AA）個(gè)體IS風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=1.30，95％ CI=1.05-1.62，P=0.017），且IS患者風(fēng)險(xiǎn)單倍型(rs233113A/rs233112A)的頻率顯著高于rs233113A/rs233112G和rs233113 T/rs233112A單倍型(P=0.017和P=0.026)。
　　5.AGXT2 rs37369、DDAH1 rs233113和rs2

21、33112與IS預(yù)后不相關(guān)，但是在發(fā)現(xiàn)人群和合并人群中有事件發(fā)生的IS患者中rs233113 T等位(AT+TT)頻率有升高趨勢(shì)(P=0.087和P=0.097)。
　　結(jié)論:
　　1.DDAH1 rs233113和rs233112可以降低IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其可以降低伴有糖尿和高血壓的個(gè)體IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.DDAH1 rs233113和rs233112可以通過聯(lián)合作用升高IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　3.AGXT

22、2 rs37369多態(tài)與IS易感性不相關(guān)。
　　4.AGXT2 rs37369、DDAH1 rs233113和rs233112與IS的預(yù)后無顯著相關(guān)。
　　第三章:miR-455-5p對(duì)DDAH1表達(dá)調(diào)節(jié)作用及DDAH1遺傳多態(tài)性的影響
　　研究背景:
　　通過本論文第一、二章的研究，我們發(fā)現(xiàn)DDAH1 rs233113多態(tài)與冠心?。–oronary heart disease，CHD）的易感性相關(guān)，同時(shí)DDAH

23、1rs233113和rs233112多態(tài)還與缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)易感性相關(guān)。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，rs233113和rs233112多態(tài)可顯著升高原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）內(nèi)DDAH1的表達(dá)，升高細(xì)胞裂解液對(duì)ADMA的代謝活性，降低細(xì)胞內(nèi)ADMA的濃度，但這兩個(gè)SNP是否為功能性SNP，以及兩個(gè)SNP發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚。
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)一類內(nèi)源性的長

24、約22個(gè)堿基的非編碼RNA，通過與靶基因3'非編碼區(qū)(Untranslated regions，UTR)以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)。DDAH1的表達(dá)受微小RNA（MicroRNA，miRNA）調(diào)控。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p在人DDAH13'UTR區(qū)有兩個(gè)的miRNA識(shí)別元件(MicroRNA recognition elements，MRE)，其中MRE1位于rs233113上游100bp左右處，MRE2位于

25、rs233112處。通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)miR-455-5p是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的miRNA，炎癥狀態(tài)下其表達(dá)顯著升高。因此，基于本學(xué)位論文前兩章的研究基礎(chǔ)和以上背景，我們提出DDAH1 rs233112和rs233113多態(tài)可能通過影響miR-455-5p與DDAH1的結(jié)合，從而影響miR-455-5p對(duì)DDAH1的表達(dá)調(diào)控，最終影響動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究旨在查明miR-455-5p是否對(duì)DDAH1

26、產(chǎn)生直接抑制作用，查明rs233112和rs233113多態(tài)在miR-455-5p介導(dǎo)DDAH1表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用，以明確rs233112和rs233113多態(tài)性影響心腦血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的分子機(jī)制，為動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病尋找新的遺傳標(biāo)記物和防治策略。
　　方法:
　　1.miR-455-5p模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染HUVEC-C觀察對(duì)miR-455-5p表達(dá)、DDAH1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響使用不同濃度miR-45

27、5-5p mimic（20、40、80nM）轉(zhuǎn)染HUVEC-C24h，real-time PCR檢測(cè)miR-455-5p和DDAH1 mRNA表達(dá)，western-blot檢測(cè)DDAH1蛋白表達(dá)。
　　2.健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中觀察miR-455-5p和DDAH1 mRNA表達(dá)水平間相關(guān)性及rs233113和rs233112多態(tài)性的影響招募健康志愿者并抽取外周血，分離PBMC，提取PBMC中的DNA和RNA，利用

28、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行DDAH1 rs233113和rs233112基因分型，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)miR-455-5p和DDAH1 mRNA表達(dá)，Pearson相關(guān)性分析miR-455-5p與DDAH1 mRNA表達(dá)水平間的相關(guān)性。
　　3.原代HUVEC中觀察miR-455-5p與DDAH1 mRNA表達(dá)、ADMA代謝活性和細(xì)胞內(nèi)外ADMA水平間相關(guān)性及rs233

29、113和rs233112多態(tài)性的影響分離和培養(yǎng)原代HUVEC，PCR-RFLP對(duì)臍靜脈組織進(jìn)行基因分型，第4代內(nèi)皮細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)24小時(shí)后，real-time PCR檢測(cè)DDAH1 mRNA表達(dá)，westem-blot檢測(cè)DDAH1蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外ADMA濃度以及ADMA代謝活性，Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行結(jié)果分析。
　　4.腫瘤壞死因子α(TNF-α)處理HUVEC-C觀察miR-455-5P、DDAH1m

30、RNA和蛋白表達(dá)變化不同濃度TNF-α(25、50、100 ng/ml)處理HUVEC-C24h后，real-time PCR檢測(cè)miR-455-5p和DDAH1 mRNA表達(dá)，western-blot檢測(cè)DDAH1蛋白表達(dá)。
　　5.HUVEC-C和HEK293細(xì)胞中miR-455-5p與不同報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)報(bào)告基因活性的影響PCR擴(kuò)增DDAH1基因3'-UTR區(qū)含miR-455-5p兩個(gè)MRE的序列，連接到雙報(bào)告基因質(zhì)粒p

31、mirGLO上，定點(diǎn)突變兩個(gè)位點(diǎn)分別包含rs233113和rs233112多態(tài)位點(diǎn)不同單倍型的質(zhì)粒(rs233113A-rs233112A、rs233113A-rs233112G、rs233113T-rs233112A和rs233113T-rs233112G)，以及兩個(gè)MRE分別為野生型和突變體的質(zhì)粒[MRE1-A-A（野生型質(zhì)粒）、MRE1-A-MRE2mut、MRE1-T-MRE2mut、MRE1mut-A-A、MRE1mut-A-

32、G、MRE1mut-A-MRE2mut]，將報(bào)告基因質(zhì)粒與不同濃度miR-455-5pmimic（10、20、40nM）或陰性對(duì)照（20nM）共同轉(zhuǎn)染HUVEC-C和HEK293細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞并取裂解液，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定熒光素酶活性，查明miR-455-5p模擬物對(duì)不同質(zhì)粒報(bào)告基因活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.HUVEC-C轉(zhuǎn)染miR-455-5p mimic24h呈濃度依賴性地上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-455-

33、5p表達(dá)(P＜0.05)，同時(shí)DDAH1三個(gè)轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)及DDAH1蛋白表達(dá)顯著下降。
　　2.不同濃度TNF-α(25、50、100ng/ml)處理HUVEC24h均可顯著上調(diào)HUVEC細(xì)胞內(nèi)miR-455-5p表達(dá)(P＜0.05)，100ng/ml TNF-α可顯著下調(diào)DDAH1三個(gè)轉(zhuǎn)錄本mRNA表達(dá)(P＜0.05)，50ng/ml和100ng/ml TNF-α處理可顯著下調(diào)DDAH1蛋白表達(dá)，但25ng/mlTNF-

34、α對(duì)DDAH1的蛋白表達(dá)無顯著影響。
　　3.在攜帶rs233113 T等位基因的個(gè)體來源的PBMC中，miR-455-5p和DDAH1-V1 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.636，P=0.026，n=12);在原代培養(yǎng)的HUVEC中，miR-455-5p和DDAH1-V1 mRNA表達(dá)也呈顯著的負(fù)相關(guān)（R=-0.512，P=0.018，n=21），且這種顯著的相關(guān)性主要出現(xiàn)在攜帶rs233113T等位和rs233112G等

35、位的個(gè)體來源的HUVEC中（rs233113 T等位基因攜帶者:R=-0.764，P=0.017，n=9; rs233112G等位基因攜帶者:R=-0.660，P=0.010，n=14)。
　　4.在原代培養(yǎng)的HUVEC中，miR-455-5p表達(dá)水平與細(xì)胞裂解液ADMA的代謝活性間呈顯著的負(fù)相關(guān)（R=-0.608，P=0.036，n=12），與細(xì)胞內(nèi)ADMA水平呈顯著正相關(guān)（R=0.628，P=0.029，n=12）。
　

36、　5.在HUVEC-C和HEK293細(xì)胞中，10、20、40nM的miR-455-5pmimic均可顯著下調(diào)rs233113A-rs233112A、rs233113A-rs233112G和rs233113T-rs233112A報(bào)告基因質(zhì)粒活性;但對(duì)于rs233113T-rs233112G報(bào)告基因質(zhì)粒，在HUVEC-C中只有20和40nM miR-455-5p mimic處理可顯著下調(diào)該質(zhì)粒的報(bào)告基因活性，而在HEK293細(xì)胞中，只有40

37、nM miR-455-5p mimic才可顯著下調(diào)該報(bào)告基因質(zhì)粒的報(bào)告基因活性。
　　6.HUVEC-C中，10、20、40nM的miR-455-5p mimic均可以顯著下調(diào)MRE1-A-A（野生型質(zhì)粒）和MRE1-A-MRE2mut（MRE2識(shí)別位點(diǎn)突變質(zhì)粒）質(zhì)粒報(bào)告基因活性，20和40nM的miR-455-5pmimic可顯著下調(diào)MRE1mut-A-A（MRE1識(shí)別位點(diǎn)突變質(zhì)粒）質(zhì)粒報(bào)告基因活性，但是各濃度miR-455-5

38、p mimic均不影響MRE1-T-MRE2mut、MRE1 mut-A-G和MRE1mut-A-MRE2mut質(zhì)粒的報(bào)告基因活性。
　　結(jié)論:
　　1.DDAH1是miR-455-5p的靶基因，同時(shí)通過DDAH13'-UTR區(qū)的兩個(gè)MRE發(fā)揮抑制DDAH1表達(dá)的作用;
　　2.TNF-α可通過上調(diào)miR-455-5p的表達(dá)，從而下調(diào)DDAH1的表達(dá)。
　　3.DDAH1 rs233113和rs233112多態(tài)性