華支睪吸蟲轉錄和代謝酶相關基因的表達及生物學活性初步鑒定.pdf

1、本次研究利用生物信息學方法,對華支睪吸蟲eDNA文庫的EST序列進行大規(guī)模同源性分析和Unigene拼接,篩選出RPEF(RNA polymeraseⅡ elongation factor)、TC(Transcriptional coactivator)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)三個基因作為本次研究對象,其研究內容主要包括:對華支睪吸蟲cDNA文庫所有ESTs 5'端

2、測序結果和3'端測序結果,通過Wu-Blast程序進行Unigene歸并,同時使用phrap軟件對克隆進行序列拼接.使用NCBI上的Blastx程序尋找同源蛋白,預測編碼蛋白的生物學功能.使用PCGENE軟件、Antheprot-5軟件和ExPASy程序分析編碼蛋白的二級結構特征及搜尋功能性位點(Site)、功能性結構域(Domain),Swiss-model進行蛋白三維模建.采用PCR方法從成蟲cDNA文庫中擴增出RPEF基因、TC基

3、因并測序鑒定.將CsRPEF基因、CsTC基因分別克隆入原核表達載體pGEX-4T-1和PET-30a(+),經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定重組子是否正確.將重組子pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH(前期工作)和PET-TC在大腸桿菌BL21系統(tǒng)中經(jīng)IPTG誘導進行大規(guī)模表達.對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析,檢測重組蛋白分子量是否與預測值一致.使用GST的單抗和抗華支睪吸蟲免疫兔血清進行Western blot免

4、疫識別,鑒定重組蛋白pGEX-4T-1-RPEF和PET-TC是否正確表達和具有免疫學活性.分別使用Novagen公司的GST·Bind<'TM>kit和His·Bind<'TM>purification kit按照操作說明親和純化重組蛋白pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH和PET-TC,并使用thrombin凝血酶對經(jīng)GST親和層析柱純化的融合蛋白GST-RPEF、GST-GAPDH進行酶切,Wash buf

5、fer再次過柱洗脫.分別對純化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、PET-TC進行SDS-PAGE分析和凝膠掃描分析,鑒定重組蛋白純化效果和含量.采用Bradford法對所獲得的純化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、CsTC的濃度分別進行測定.上述實驗結果表明此次實驗所獲得的純化蛋白可以很好的用于后續(xù)的基因生物學功能和結構的實驗室鑒定.將純化的目的蛋白CsRPEF、CsTC、CsGAPDH分別免疫BALB/C小鼠,40天后制備其免疫蛋白抗

6、血清.采用間接ELISA法檢測抗血清IgG抗體滴度及抗體產(chǎn)生的情況,同時采用Western blot免疫識別來鑒定制備的抗血清抗三種目的蛋白的特異性.采用S-P濃縮型免疫組化三步法對CsRPEF、CsTC、CsGAPDH三基因在華支睪吸蟲成蟲中的組織分布進行定位,同時采用熒光免疫定位法對Cs GAPDH基因在華支睪吸蟲成蟲和免疫小鼠中的分布和表達情況進一步加以確證.采用GAPDH的通用底物3-GAP(三磷酸甘油醛)反應體系來鑒定純化蛋白

7、CsGAPDH的酶催化活性.選擇不同3-GAP濃度,測定GAPDH與催化底物轉化量之間關系.選擇不同的競爭性抑制劑AMP的濃度作用于酶反應體系,測定AMP對催化底物轉化量NADH的影響,依據(jù)5分鐘之內不同時間點的光密度值(ABS),計算重組蛋白CsGAPDH酶活力單位.本文通過生物信息學方法從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中篩選出了RNA聚合酶Ⅱ延長因子(RNA polymerase Ⅱ elongation factor)、轉錄激活因子(

8、transcriptional coactivator)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因,成功將三個基因予以克隆,表達,酶切、純化,動物免疫實驗獲取了三個重組蛋白的抗血清,免疫組織化學法對三個基因在華支睪吸蟲成蟲中的組織分布分別進行了定位,并完成了重組蛋白CsGAPDH酶催化活性的初步測定.上述研究結果可為更深入地分析這三個基因的生物學功能以及華支睪吸蟲病理想