應(yīng)用免疫學(xué)方法及PCR技術(shù)檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)的研究.pdf

1、目的：⑴建立敏感、特異的雙抗夾心ELISA法，檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)病人糞樣中的排泄分泌抗原(excreted-secretory antigen，ES antigen)，用于測(cè)定人群中華支睪吸蟲(chóng)的感染；⑵建立高特異、高靈敏的PCR方法，檢測(cè)魚(yú)肉中的華支睪吸蟲(chóng)囊蚴DNA，應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)食品的衛(wèi)生檢疫及華支睪吸蟲(chóng)中間宿主的感染調(diào)查。
　　 方法：①對(duì)17株華支睪吸蟲(chóng)單克隆抗體應(yīng)用間接ELISA法確定其亞類(lèi)，并用位點(diǎn)阻斷ELISA法，進(jìn)行位點(diǎn)類(lèi)

2、別分類(lèi)；②采用單抗和單抗或單抗和多抗之間的二二配對(duì)實(shí)驗(yàn)，以?shī)A心ELISA法篩選最佳抗體組合；③比較常規(guī)雙抗夾心ELISA法和生物素-鏈親和素(Biotin-Streptavidin，BS)雙抗夾心ELISA法檢測(cè)ES抗原的敏感性，確定糞ES抗原的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)；④通過(guò)對(duì)兩種糞ES抗原抽提方法BSA法和PBS法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，確定最佳糞ES抗原的抽提方法；⑤通過(guò)檢測(cè)純化的ES抗原、模擬糞ES抗原、華支睪吸蟲(chóng)病人糞樣和其他消化道寄生蟲(chóng)病

3、人糞樣對(duì)建立的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行敏感性和特異性的初步評(píng)估；⑥對(duì)以引物CS1F/CS1R建立的PCR體系中的Mg2+濃度、引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的PCR反應(yīng)條件；⑦通過(guò)檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)囊蚴DNA和其他吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的DNA對(duì)引物為CS1F/CS1R和OP2/Cs的二組PCR反應(yīng)體系進(jìn)行敏感性和特異性分析；⑧對(duì)比研究蛋白酶K簡(jiǎn)單消化法、煮沸法和消化-煮沸法等三種DNA抽提方法，建立從感染華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的魚(yú)肉中抽提DNA的最佳方

4、法；⑨通過(guò)檢測(cè)31條華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性麥穗魚(yú)和31條陰性魚(yú)對(duì)建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行初步評(píng)估。
　　 結(jié)果：⑴17株華支睪吸蟲(chóng)單抗分成兩類(lèi)單抗亞類(lèi)，其中Cs30和Cs32兩株單抗屬于IgM，其余15株為IgG1；單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)也分成兩類(lèi)，其中Cs30、Cs13、Cs17、Cs51和Cs32五株單抗識(shí)別同一抗原表位，其余12株單抗(包括Cs63)則識(shí)別另一相同的抗原表位；⑵對(duì)17株單抗中效價(jià)最高的Cs32和Cs63進(jìn)行特異性評(píng)估，兩

5、株單抗均不與血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原、血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵抗原以及衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出對(duì)華支睪吸蟲(chóng)高度的特異性；⑶通過(guò)二二抗體配對(duì)試驗(yàn)篩選出最佳抗體夾心組合為單抗+多抗；⑷在同樣的單抗包被(Cs32或Cs63)條件下，BS-ELISA檢測(cè)系統(tǒng)比HRP-ELISA檢測(cè)系統(tǒng)更敏感，可用于糞ES抗原檢測(cè)；⑸確定BS-ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)糞ES抗原，抽提糞ES方法為PBS法，包被抗體為Cs63；該系統(tǒng)可檢測(cè)到23.4ng的糞ES

6、抗原；⑹應(yīng)用建立的生物素-鏈親和素雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)病人的敏感度為80.9％，其中對(duì)每克糞蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)大于500的中高感染度的華支睪吸蟲(chóng)病人能夠100％檢出；檢測(cè)蛔蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)等其他寄生蟲(chóng)病人的糞樣以及正常人糞樣，僅與蛔蟲(chóng)(13％)、鞭蟲(chóng)(10.5％)病人糞樣有部分交叉反應(yīng)，檢測(cè)正常人糞樣有9.4％的假陽(yáng)性；⑺經(jīng)優(yōu)化，以CS1F/CS1R為引物的PCR體系最佳反應(yīng)條件是：引物濃度為0.67uM、Mg2

7、+濃度為1.5-2.0 mM，退火溫度為53.5℃；⑻特異性引物CS1F/CS1R可從華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和成蟲(chóng)DNA中擴(kuò)增出283bp的特異性片段，另一特異性引物OP2/Cs則擴(kuò)增出301bp的特異性片段；兩對(duì)引物對(duì)宮川棘口吸蟲(chóng)、抱莖棘隙吸蟲(chóng)、東方次睪吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)等基因組DNA均未擴(kuò)增出任何條帶；結(jié)果表明，兩對(duì)引物具有對(duì)華支睪吸蟲(chóng)高度的特異性；⑼引物為CS1F/CS1R的PCR檢測(cè)體系最低能檢測(cè)到0.67個(gè)C.s囊蚴，引物

8、為OP2/Cs時(shí)則能檢測(cè)出4×10-5個(gè)C.s囊蚴，敏感性?xún)?yōu)于CS1F/CS1R的PCR檢測(cè)體系，可用于魚(yú)肉中的華支睪吸蟲(chóng)囊蚴DNA的檢測(cè)；⑽確定以消化-煮沸法從感染華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的魚(yú)肉中抽提囊蚴DNA，DNA提取液最佳用量為10-15μl；⑾應(yīng)用經(jīng)優(yōu)化的PCR檢測(cè)方法檢測(cè)31個(gè)華支睪吸蟲(chóng)陽(yáng)性魚(yú)樣品均擴(kuò)增出301bp的特異性條帶，陽(yáng)性檢出率為100％；31個(gè)陰性樣品，均未擴(kuò)增出特異性條帶，假陽(yáng)性率為0。
　　 結(jié)論：①本研究建立

9、的生物素-鏈親和素雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)糞ES抗原具有較高的敏感性和特異性，對(duì)測(cè)定人群中華支睪吸蟲(chóng)的感染具有一定的應(yīng)用前景；②引物CS1F/CS1R和OP2/Cs對(duì)華支睪吸蟲(chóng)DNA都具有高度的特異性，并且引物OP2/Cs具有更高的敏感性，能檢測(cè)到4×10-5個(gè)C.s囊蚴；③建立了從感染華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的魚(yú)肉中抽提囊蚴DNA的方法(消化-煮沸法)，并用于引物為OP2/Cs的PCR檢測(cè)方法，檢出率100％，假陽(yáng)性率0，有望應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)食