IBDV抗原表位與HBcAg嵌合體基因的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物免疫功能分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害雛雞淋巴組織,特別是中樞免疫器官—法氏囊為主要特征的傳染病。該病不僅引起患病動物死亡,而且還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制,使機(jī)體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗,對易感雞群實(shí)施疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法,但由于各地流行的IBDV毒株的毒力與抗原性的差異,給疫苗毒株的選擇造成較大的困難,每年由于IBD免疫失敗或免疫抑制造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。為了抵抗超強(qiáng)毒的攻擊以及母源抗體的干

2、擾,目前廣泛應(yīng)用中等毒力的IBD活疫苗,給IBD的防控帶來極大的隱患,滅活疫苗存在著抗原制備的困難。鑒于此,進(jìn)一步分析當(dāng)前IBDV的分子流行病學(xué)、研制新型的基因工程疫苗,仍是當(dāng)前禽病防控工作中亟待解決的重要課題。研究內(nèi)容包括兩個部分:
　　 試驗(yàn)1:IBDV抗原表位與HBcAg嵌合體基因的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物分析為了提高模擬IBDV多表位基因5epis的免疫效力,運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù),在乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的23

3、1位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸殘基)之間插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn),構(gòu)建基于HBcAg修飾基因(mHBc)的抗原表位嵌合體基因分子載體pET-mHBc。將模擬IBDV多表位基因5epis定向插入到pET-mHBc的mHBc基因中,獲得嵌合體基因mHBc-5epis表達(dá)質(zhì)粒pET-mHBc-5epis,在大腸桿菌中表達(dá)。用SDS-PAGE分析,重組嵌合體蛋白的分子量約為29 ku；在wlestern-blotting試

4、驗(yàn)中,重組嵌合體蛋白與IBDV抗體反應(yīng)形成1條特異性蛋白帶。將重組菌超聲破碎后,用電鏡觀察,可見重組嵌合體蛋白呈病毒樣顆粒(VLP),直徑約100 nm～120 nm；用IBDv抗體夾心ELISA檢測,抗原效價達(dá)到1:200。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了5epis與HBcAg嵌合體基因,在大腸桿菌申高效表達(dá)具有IBDV抗原反應(yīng)性的重組病毒樣顆粒嵌合體蛋白,為表位型IBD基因工程疫苗的研究提供了一條新途徑。
　　 試驗(yàn)2:重組mHBc-5ep

5、is嵌合體蛋白的免疫功能分析將重組菌 pET-mHBc-5epis誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE膠回收方法純化重組mHBc-5epis嵌合體蛋白,免疫1月齡SPF雞,雙抗體夾心ELISA法檢測免疫雞血清中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6動態(tài)變化,在免疫后的第2天IL-2、IL-4表達(dá)量都有明顯上升；用間接ELISA法檢測免疫雞血清中IBDV抗體,在免疫后的第14天IBDV抗體效價達(dá)到1:100。試驗(yàn)表明,嵌合體基因HBcAg分子