大蒜素對TRAIL誘導卵巢癌細胞SKOV-3凋亡影響的體外實驗研究.pdf

1、目的：卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率高，治療效果差。隨著新輔助化療的發(fā)展和醫(yī)學模式的轉(zhuǎn)變，化療己成為卵巢癌治療中不可或缺的治療手段。在卵巢癌的化療中，使用一些毒性小的抗腫瘤藥物，充分發(fā)揮其治療作用，減少對正常細胞的損傷，成為當前研究的一大熱點。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子TNF家族成員，能夠選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡且不影響正常細胞的生長分化，

2、在腫瘤治療方面具有潛在的應用價值。大蒜素(Allicim)是大蒜中主要生物活性成分的總稱。近年來，實驗證實大蒜素能夠通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生。 本研究以人卵巢癌SKOV-3細胞株為對象，探討大蒜素與TRAIL單獨及聯(lián)合應用對卵巢癌細胞生長的影響及其作用機理，從而為臨床上卵巢癌的化療提供新的思路。 方法： 1. 細胞培養(yǎng)：常規(guī)復蘇凍存的SKOV-3細胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，加入青、鏈霉素，使青霉素濃度

3、為100IU/ml，鏈霉素濃度為100ug/ml，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育。以0.25％胰蛋白酶消化傳代。 2.細胞增殖實驗：取對數(shù)生長的SKOV-3細胞，制成濃度為6x104個/ml的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，每孔100ul，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，按以下幾組分別加入含藥培基：(1) 含有不同濃度大蒜素(12.5、25、50、75mg/L)的培養(yǎng)基；(2) 含有不同濃度TRAIL

4、蛋白(25、50、100、200ng/ml)的培養(yǎng)基；(3) 含有100ng/ml的TRAIL蛋白和50mg/L大蒜素的培養(yǎng)基；(4) 空白對照孔(只加培養(yǎng)基)。每一濃度均設6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時后，每孔加入10ul濃度為5mg/ml的MTT溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4小時。吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜100ul，振蕩器上振蕩8-10min，用酶標光度儀在波長為492nm時測定每孔的吸光度(OD)值。每個實驗均重復3次

5、。 3.流式細胞儀檢測大蒜素對SKOV-3細胞TRAIL死亡受體DR4、DR5表達的影響：將濃度為4.5x104個/ml細胞接種于培養(yǎng)瓶。待細胞生長至對數(shù)生長期，換培養(yǎng)液，分為對照組(僅加培養(yǎng)基)、大蒜素組(加入含大蒜素50mg/L的培基)，培養(yǎng)24h后，收集細胞，上樣流式細胞儀進行死亡受體表達量分析，以檢測樣品熒光指數(shù)(FI)表示。實驗重復三次取平均值計算大蒜素處理前后細胞死亡表達的FI值。 4.用Caspase活性檢

6、測試劑盒檢測大蒜素對SKOV-3細胞株Caspase-3、8活性的影響：將濃度為4.5x104個/ml細胞接種于接種于培養(yǎng)瓶。待細胞生長至對數(shù)生長期，換培養(yǎng)液，分為對照組(僅加培養(yǎng)基)、大蒜素組(力口入含大蒜素50mg/L的培基)，培養(yǎng)48h后，收集細胞，按照說明書操作，用分光光度計測定OD405。通過OD試驗組/OD空白組的比值檢測大蒜素對卵巢癌SKOV-3細胞Caspase-3、8活化程度的影響。實驗重復三次。 5.RT-P

7、CR法檢測大蒜素對SKOV-3細胞TRAIL死亡受體DR4、DR5及Caspase-3、8表達的影響：取對數(shù)生長期細胞以4.5x104/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)，待每瓶細胞生長至80-90％時，設對照組(僅加培養(yǎng)基)和加藥組(含50mg/L大蒜素的含藥培基)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時后，收集細胞提取總RNA，cDNA的合成，PCR的擴增及瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)觀察DR4、DR5及Caspase-3、8與β-actin基因擴增產(chǎn)

8、物電泳條帶的吸光度比值，表示DR4、DR5與Caspase-3、8的相對表達水平。實驗重復三次，取平均值。統(tǒng)計學方法：細胞吸光度值(OD)和DR4、DR5、Caspase-3、8表達用-X±s表達，兩個樣本均數(shù)的比較用t檢驗；三組及以上資料的多組間比較，采用方差分析。計數(shù)資料用χ2檢驗。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包進行統(tǒng)計。P<0.05為差異有顯著性意義。 結果： 1.SKOV-3細胞的形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡觀察：對照組細胞

9、生長狀態(tài)良好，細胞伸展，呈梭形。加藥培養(yǎng)24h后細胞數(shù)目減少，細胞明顯皺縮，體積變小，細胞間隙增大，有凋亡小體形成。 2.大蒜素和TRAIL對SKOV-3細胞生長影響：大蒜素和TRAIL單獨以及聯(lián)合應用處理人卵巢癌SKOV-3細胞24、48、72h后，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高，表現(xiàn)為時間和劑量依賴關系。各組細胞抑制率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.流式細胞儀檢測：大蒜素作用24小時后

10、SKOV-3細胞TRAIL死亡受體的表達明顯上調(diào)，DR4、DR5的FI值分別由用藥前的1.78、1.94升高到2.27、2.58，用藥前后DR4、DR5表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4.Caspase-3、8活性檢測：經(jīng)大蒜素作用48小時后，SKOV-3細胞Caspase-3、8活性明顯增加，Caspase-3、8活性的OD試驗組/OD空白組分別是用藥前的2.49、2.08倍，用藥前后Caspase-3、8活性差異有統(tǒng)

11、計學意義(P<0.05)。 5.RT-PCR檢測：經(jīng)大蒜素作用8小時后，DR4、DR5及Caspase-3、8 mRNA基因擴增產(chǎn)物與β-actin基因擴增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值明顯升高，DR4、DR5為對照組的1.45、1.52倍，Caspase-3、8分別為對照組的2.03、1.55倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論：(1) 卵巢癌SKOV-3細胞是大蒜素和TRAIL敏感細胞株。(2) 大蒜素可以增強TRA