大蒜素對(duì)TRAIL誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3凋亡影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率高，治療效果差。隨著新輔助化療的發(fā)展和醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，化療己成為卵巢癌治療中不可或缺的治療手段。在卵巢癌的化療中，使用一些毒性小的抗腫瘤藥物，充分發(fā)揮其治療作用，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子TNF家族成員，能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，

2、在腫瘤治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。大蒜素(Allicim)是大蒜中主要生物活性成分的總稱。近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)大蒜素能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤的發(fā)生。 本研究以人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株為對(duì)象，探討大蒜素與TRAIL單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)理，從而為臨床上卵巢癌的化療提供新的思路。 方法： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)復(fù)蘇凍存的SKOV-3細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，加入青、鏈霉素，使青霉素濃度

3、為100IU/ml，鏈霉素濃度為100ug/ml，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)松蓋培育。以0.25％胰蛋白酶消化傳代。 2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SKOV-3細(xì)胞，制成濃度為6x104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，每孔100ul，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，按以下幾組分別加入含藥培基：(1) 含有不同濃度大蒜素(12.5、25、50、75mg/L)的培養(yǎng)基；(2) 含有不同濃度TRAIL

4、蛋白(25、50、100、200ng/ml)的培養(yǎng)基；(3) 含有100ng/ml的TRAIL蛋白和50mg/L大蒜素的培養(yǎng)基；(4) 空白對(duì)照孔(只加培養(yǎng)基)。每一濃度均設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，每孔加入10ul濃度為5mg/ml的MTT溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4小時(shí)。吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜100ul，振蕩器上振蕩8-10min，用酶標(biāo)光度儀在波長(zhǎng)為492nm時(shí)測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次

5、。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)大蒜素對(duì)SKOV-3細(xì)胞TRAIL死亡受體DR4、DR5表達(dá)的影響：將濃度為4.5x104個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換培養(yǎng)液，分為對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基)、大蒜素組(加入含大蒜素50mg/L的培基)，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，上樣流式細(xì)胞儀進(jìn)行死亡受體表達(dá)量分析，以檢測(cè)樣品熒光指數(shù)(FI)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值計(jì)算大蒜素處理前后細(xì)胞死亡表達(dá)的FI值。 4.用Caspase活性檢

6、測(cè)試劑盒檢測(cè)大蒜素對(duì)SKOV-3細(xì)胞株Caspase-3、8活性的影響：將濃度為4.5x104個(gè)/ml細(xì)胞接種于接種于培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換培養(yǎng)液，分為對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基)、大蒜素組(力口入含大蒜素50mg/L的培基)，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書操作，用分光光度計(jì)測(cè)定OD405。通過(guò)OD試驗(yàn)組/OD空白組的比值檢測(cè)大蒜素對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞Caspase-3、8活化程度的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 5.RT-P

7、CR法檢測(cè)大蒜素對(duì)SKOV-3細(xì)胞TRAIL死亡受體DR4、DR5及Caspase-3、8表達(dá)的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以4.5x104/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，置于孵箱中培養(yǎng)，待每瓶細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％時(shí)，設(shè)對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基)和加藥組(含50mg/L大蒜素的含藥培基)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)后，收集細(xì)胞提取總RNA，cDNA的合成，PCR的擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)觀察DR4、DR5及Caspase-3、8與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)

8、物電泳條帶的吸光度比值，表示DR4、DR5與Caspase-3、8的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：細(xì)胞吸光度值(OD)和DR4、DR5、Caspase-3、8表達(dá)用-X±s表達(dá)，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；三組及以上資料的多組間比較，采用方差分析。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.SKOV-3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡觀察：對(duì)照組細(xì)胞

9、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞伸展，呈梭形。加藥培養(yǎng)24h后細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞明顯皺縮，體積變小，細(xì)胞間隙增大，有凋亡小體形成。 2.大蒜素和TRAIL對(duì)SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)影響：大蒜素和TRAIL單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用處理人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞24、48、72h后，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，抑制率增高，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。各組細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：大蒜素作用24小時(shí)后

10、SKOV-3細(xì)胞TRAIL死亡受體的表達(dá)明顯上調(diào)，DR4、DR5的FI值分別由用藥前的1.78、1.94升高到2.27、2.58，用藥前后DR4、DR5表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.Caspase-3、8活性檢測(cè)：經(jīng)大蒜素作用48小時(shí)后，SKOV-3細(xì)胞Caspase-3、8活性明顯增加，Caspase-3、8活性的OD試驗(yàn)組/OD空白組分別是用藥前的2.49、2.08倍，用藥前后Caspase-3、8活性差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5.RT-PCR檢測(cè)：經(jīng)大蒜素作用8小時(shí)后，DR4、DR5及Caspase-3、8 mRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的吸光度比值明顯升高，DR4、DR5為對(duì)照組的1.45、1.52倍，Caspase-3、8分別為對(duì)照組的2.03、1.55倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：(1) 卵巢癌SKOV-3細(xì)胞是大蒜素和TRAIL敏感細(xì)胞株。(2) 大蒜素可以增強(qiáng)TRA