2-甲氧基雌二醇對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MUTZ-1作用的體外研究.pdf

1、目的：以人高危骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MUTZ-1細(xì)胞為研究對(duì)象，研究2-ME對(duì)MUTZ-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并進(jìn)一步探討2-MENMUTZ-1細(xì)胞作用的可能機(jī)制，探索新的更加有效的MDS治療方法。 方法：常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，MUTZ-1細(xì)胞與2-ME孵育后，MTT法檢測(cè)2-ME對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響；通過(guò)抗原CDIIb和CDl4測(cè)定，觀察細(xì)胞膜抗原表達(dá)及細(xì)胞分化成熟；通過(guò)LDH檢測(cè)，觀察2-ME對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響；用

2、光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀術(shù)Annexin-V<'FITC>/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)位和PI染色分析細(xì)胞周期的變化；JC-1染色后檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化；DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的改變；瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA"梯狀"條帶；用發(fā)光比色法檢測(cè)caSpase-3活性；采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)抗凋亡基因Mcl-1、XIAP和促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1)0.5μmol/L2-M

3、E作用MUTZ-1細(xì)胞2周后，細(xì)胞分化抗原CD11b和CD14表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。 2)1～16μmol/L2-ME能夠抑制MUTZ-1細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度增加，2-ME對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 3)4μmol/L2-ME作用MUTZ-1細(xì)胞12h后，呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征。 4)MUTZ-1細(xì)胞與2-ME孵育36h后，培養(yǎng)上清液中LD

4、H含量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加而明顯升高，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示1～8μmol/L2-ME具有誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6)2-ME作用MUTZ-1細(xì)胞12h后，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞和S期細(xì)胞逐漸減少，G<,2>/M期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞阻滯于G<,2>/M期

5、。 7)2-ME作用MUTZ-1細(xì)胞6h后，細(xì)胞△ψm強(qiáng)度下降(9.4±1.8)％，4μmol/L2-ME作用18h時(shí)細(xì)胞△ψm降低到最大值(88.4±4.2)％，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，△ψm下降減緩；4μmol/L2-ME作用MUTZ-1細(xì)胞6h后，細(xì)胞內(nèi)ROS升高(75.8±3.2)％，18h時(shí)ROS升高到最大值(162.4±4.7)％，且ROS升高與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的△ψm下降成正相關(guān)(r=0.036，p<0.05)。隨著2-ME

6、濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比明顯增多。 8)2-ME作用MUTZ-1細(xì)胞24h后，DNA凝膠電泳可見(jiàn)明顯的DNA"梯狀"條帶，條帶亮度具有濃度依賴性。 9)caspase-3活性隨著2-ME濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。 10)在一定條件下，隨著2-ME濃度的增加，MUTZ-1細(xì)胞中Mcl-lmRNA表達(dá)量逐漸降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；XIAP mRNA和Bax mRNA表

7、達(dá)量未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論： 1)低濃度2.ME(<0.5μmol/L)對(duì)MUTZ-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用不明顯。 2)2-ME對(duì)MDS細(xì)胞株MUTZ.1細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈現(xiàn)時(shí)效關(guān)系，在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。2-ME體外抗腫瘤作用可能與MUTZ-1細(xì)胞G2/M期阻滯有關(guān)。 3)2.ME能夠誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，誘導(dǎo)MDS細(xì)胞凋亡是2-ME抗腫瘤作用的機(jī)