維生素K2對(duì)骨髓增生異常綜合征細(xì)胞株MDS-JSN04細(xì)胞作用的體外研究.pdf

1、目的：以人骨髓增生異常綜合征（MDS）細(xì)胞株MDS-JSN04細(xì)胞為研究對(duì)象，探討維生素K2（VK2）對(duì)MDS-JSN04細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并進(jìn)一步研究VK2對(duì)MDS-JSN04細(xì)胞作用的可能機(jī)制，以期為臨床選用VK2治療MDS提供理論依據(jù)。 方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDS-JSN04細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105ml，分別加入不同濃度VK2（0、5、10、20和40μmol·L-1），培養(yǎng)不同時(shí)間（24、48、72和9

2、6h），采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法觀察VK2處理后細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變；應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)VK2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期變化和髓系分化抗原CD11b、CD14的表達(dá)情況；瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA“梯狀”條帶；用發(fā)光比色法檢測(cè)Caspase-3活性；采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)抗凋亡基因Survivin、Bcl-2和促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)。 結(jié)果：1）10μmol·L-1及以上濃度的VK

3、2作用MDS-JSN04細(xì)胞48h后，細(xì)胞體積開(kāi)始變小，核染色質(zhì)固縮并積聚于核膜下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)DNA斷裂形成典型凋亡小體等形態(tài)學(xué)特征，且隨著VK2濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞所占的百分比明顯增高；2）MTT結(jié)果顯示，低濃度（5μmol·L-1）的VK2對(duì)MDS-JSN04細(xì)胞有一定的促增殖作用，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0．05），10μmol·L-1及以上濃度的VK2處理MDS-JSN04細(xì)胞株48h后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯

4、受抑，并呈濃度依賴(lài)性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與對(duì)照組有顯著性差異（P<0．01）；隨著VK2與MDS-JSN04細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（48、72和96h），生長(zhǎng)抑制率亦明顯增高，與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01），即呈時(shí)間依賴(lài)性；3）流式結(jié)果顯示：a）MDS-JSN04細(xì)胞在低濃度VK2（5μmol·L-1）的環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)15天后（每3天傳代一次，保持藥物濃度不變），流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，髓系分化抗原CD11b和CD14沒(méi)有明顯的改變

5、，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）；c）5μmol·L-1VK2處理。MDS-JSN04細(xì)胞不同時(shí)間（24、48、72和96h），細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組之間沒(méi)有明顯的差異，而10μmol·L-1及以上濃度的VK2具有明顯的誘導(dǎo)MDS-JSN04細(xì)胞凋亡的作用，且在一定的藥物濃度、一定的時(shí)間范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，具有明顯的濃度、時(shí)間依賴(lài)性，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；c

6、）細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多（P<0．01），細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，并且在G0/G1期前出現(xiàn)明顯的亞G1期峰，即凋亡峰；4）VK2作用MDS-JSN04細(xì)胞72h后，DNA凝膠電泳可見(jiàn)明顯的DNA“梯狀”條帶，條帶亮度具有濃度依賴(lài)性；5）Caspase-3活性隨著VK2濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)（P<0．05）；7）RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：隨著VK2濃度的增高抗凋亡基

7、因Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0．05），而促凋亡基因BaxmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0．05）。 結(jié)論：1）低濃度VK2（5μmol·L-1）對(duì)MDS-JSN04細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用不明顯；2）10μmol·L-1及以上濃度的VK2對(duì)MDS細(xì)胞株MDS-JSN04細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且在一定的濃度和一定的時(shí)間范圍內(nèi)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)效和量效關(guān)系；3）VK2體外抗腫瘤作用可能與MDS-JSN04細(xì)胞G