杞菊地黃湯防治MNU誘導大鼠視網(wǎng)膜變性的實驗研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration，RD)疾病如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)等因其致盲率逐年上升，已成為危害人類健康的主要致盲性眼病之一。該病發(fā)生機制不清，目前仍無肯定療效的防治策略。因此，尋找毒副作用小的中藥已成為治療此類疾病的主要努力方向。 建立良好的實驗動物模型是研究的關鍵。N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)是廣泛分布在環(huán)境中的亞硝基化合物

2、，具有強致畸、致癌、致突變作用，一直用于腫瘤學方面的研究。實驗證實，大鼠腹腔注射MNU可選擇性地誘導光感受器細胞發(fā)生凋亡。傳統(tǒng)中藥杞菊地黃湯具有滋補肝腎、滋腎填精、清肝明目的功效，已在眼科應用多年，是經(jīng)典補益藥方。 對于視網(wǎng)膜變性疾病的研究一直以來多集中于凋亡發(fā)生的相對后期階段、針對單個或數(shù)個基因的表達，尚缺乏對于早期、整體上游分子事件的全景式探討；中藥杞菊地黃湯只有傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論基礎，缺乏可以量化的現(xiàn)代生物醫(yī)學理論依據(jù)，而高

3、通量基因芯片技術的發(fā)展與應用，為解決上述問題帶來了新的契機。本研究擬利用基因芯片技術分析差異基因表達譜，探討MNU誘導大鼠視網(wǎng)膜變性的早期整體分子事件及杞菊地黃湯的藥理效應，為進一步針對所篩察出的候選基因進行研究提供理論基礎與方向。 第一部分杞菊地黃湯防治MNU誘導大鼠視網(wǎng)膜變性的早期形態(tài)學觀察。 目的：觀察杞菊地黃湯在MNu誘導的Sprague-Dawley(SD)大鼠視網(wǎng)膜變性的早期形態(tài)學改變。 方法：

4、 (1) 實驗分組：藥物組(杞菊地黃湯灌胃+MNU皮下注射)、模型組(生理鹽水灌胃+MNU皮下注射)和正常組(生理鹽水灌胃+生理鹽水皮下注射)；藥物注射后12h，頸椎脫臼猝死大鼠。 (2) 蘇木素-伊紅(hematoxylin and erosin，H&E)染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學改變并測量分析視網(wǎng)膜全層及外核層厚度； (3) 透射電鏡觀察視網(wǎng)膜各層細胞超微結構的改變； (4) 末端脫氧核苷酸轉移酶介導Dutp缺口

5、末端標記(terminal deoxnucleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法檢測細胞凋亡，計算凋亡指數(shù)。 結果： (1) 光鏡下各組大鼠視網(wǎng)膜組織學未見明顯改變，視網(wǎng)膜全層及外核層厚度組間比較均無顯著性差異(P>0.05)； (2) 電鏡下正常組和藥物組光感受器細胞大小和核染色質分布均勻，模型組光感受器細胞開始變小，核染色質開始濃

6、縮，外節(jié)膜盤疏松，膜型不完整； (3) TUNEL染色見模型組和藥物組外核層存在細胞凋亡，正常組未見。 結論：杞菊地黃湯通過抑制細胞凋亡等選擇性拮抗MNU對大鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞的早期損傷。 第二部分杞菊地黃湯對MNU誘發(fā)的大鼠視網(wǎng)膜變性基因表達譜的影響。 目的：應用基因芯片技術研究杞菊地黃湯防治MNu誘導的sD大鼠視網(wǎng)膜變性差異基因表達譜變化。 方法： (1) 實驗分組：藥物組(杞菊地黃

7、湯灌胃+MNU皮下注射)、模型組(生理鹽水灌胃+MNU皮下注射)和正常組(生理鹽水灌胃+生理鹽水皮下注射)；藥物注射后12h，頸椎脫臼猝死大鼠。 (2) 抽提新鮮視網(wǎng)膜標本的總RNA用于基因芯片(cDNA microarry)分析和實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(real time-polymerase chain reaction．real-timeRT-PCR)檢測。 結果： (1) 模型組/正常組和模型組/藥

8、物組中分別有75個和118個差異表達基因(比率≥2.0)，前者主要表達為上調基因，后者主要表達為下調基因。這些基因多與信號轉導、發(fā)育、免疫和防御、凋亡等生物過程有關，主要涉及到絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路和凋亡信號通路； (2) Real-time RT-PCR結果與基因芯片結果