禽致病性大腸桿菌耐藥基因和毒力因子的分子流行病學(xué)及HPI Irp1細(xì)胞表位作用的研究.pdf

1、一、禽致病性大腸桿菌的分離鑒定及血清型分析從江蘇等5省不同地區(qū)送檢的臨床發(fā)病家禽，剖檢可見(jiàn)肝周炎、心包炎、氣囊炎、輸卵管炎及卵黃性腹膜炎等病變，采集病料分離獲得近500株細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)等生化試驗(yàn)以及三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)，證實(shí)所獲得的366株細(xì)菌為大腸桿菌。用大腸桿菌多因子血清和單因子血清進(jìn)行血清型鑒定，對(duì)其中296株測(cè)出了血清型，覆蓋了56種血清型，其中O78，O88，O24，O109，O93，O9，O1

2、1為優(yōu)勢(shì)血清型。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)禽源大腸桿菌的血清型變得日益復(fù)雜，在種類增加的基礎(chǔ)上，與地區(qū)、宿主等亦有很大相關(guān)性：(1)不同地區(qū)來(lái)源的菌株優(yōu)勢(shì)血清型不同，南通分離株優(yōu)勢(shì)血清型為O78，O24，O11，O26，O45，O74；鹽城株為O78，O87；揚(yáng)州株為O93，O24，O88；常州菌株優(yōu)勢(shì)血清型為O78，O109；徐州菌株為O78，O86，O109，O1；泰州菌株為O86，O9。(2)不同家禽來(lái)源的菌株，血清型分布有較大差異，雞、鴨、鵝

3、源菌株血清型分別有41種、21種和11種，三者優(yōu)勢(shì)血清型不同，雞源菌株為O78、O109、O88、O24，鵝源菌株為O9，O93，O88，O24四種血清型，鴨源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78，盡管鵝源菌株只有11種血清型，但O114、O118、O123、O141、O23、O73等六種血清型卻只出現(xiàn)于鵝源菌株，O128、O143兩種血清型只出現(xiàn)于鴨源菌株。只有O11、O86、O107三種血清型在三種家禽分離株中均出現(xiàn)，這一現(xiàn)象說(shuō)明，不同血清型

4、菌株可能存在宿主特異性。 二、禽致病性大腸桿菌分離株耐藥性檢測(cè)為了了解臨床用藥對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響，對(duì)346株禽致病性大腸桿菌分離菌株用圓紙片法進(jìn)行了針對(duì)氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素、磷霉素、新霉素、利福平、痢特靈、壯觀霉素、多黏菌B、阿奇霉素等19種抗生素的藥物敏感性測(cè)定，對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，結(jié)果表明在所選的19種抗生素中，禽

5、致病性大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性已十分嚴(yán)重，在測(cè)試的藥物中，一些較早使用的抗菌素氨基糖苷類藥物如鏈霉素、慶大霉素，磺胺類藥物如復(fù)方新諾明等，對(duì)大部分禽致病性大腸桿菌分離株已基本失去抗菌作用，鏈霉素、環(huán)丙沙星等多種藥物的耐藥菌株數(shù)(耐藥率)已超過(guò)50％；但APEC分離株對(duì)如頭孢噻肟、頭孢曲松，以及磷霉素類藥物等均較為敏感。APEC分離株普遍存在多重耐藥現(xiàn)象，只對(duì)1種藥物有耐藥性的菌株只有1株，能耐8種以上受試藥物的菌株有309株，占總受

6、試菌株的89.3％，部分菌株甚至對(duì)16種藥物產(chǎn)生了耐藥性。對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型菌株耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明血清型與耐藥性表型之間沒(méi)有明顯相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，在禽大腸桿菌病乃至其他細(xì)菌病的防治中要合理使用抗菌藥物，盡量減小耐藥性帶來(lái)的負(fù)面影響。 三、耐藥基因的序列分析及其在禽致病性大腸桿菌中的分子流行病學(xué)研究為了了解日益嚴(yán)重的APEC耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，本研究對(duì)耐氨基糖苷類藥物相關(guān)基因aadAl、strA、strB、aph(3′

7、)，耐β-內(nèi)酰胺類藥物相關(guān)基因oxa-1、oxa-5、oxa-31，耐磺胺類藥物相關(guān)基因sulⅡ等進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。參照Genbank中的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物結(jié)果從細(xì)菌基因組中擴(kuò)增出aadAl、strA、strB、aph(3′)、oxa-1、oxa-5、oxa-31、sulⅡ等耐藥基因，經(jīng)序列分析表明擴(kuò)增獲得的片段其基因序列與Genbank中參考序列同源性均達(dá)到97％以上。對(duì)分離保存的200多株禽致病性大腸桿菌進(jìn)行藥物抗性基因的分子流行病學(xué)

8、檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)aadAl、oxa-5陽(yáng)性率分別為49.1％和30.6％；strA、strB和sulⅡ的陽(yáng)性率超過(guò)了50％，分別為56％、65.7％和56％；aph(3)、oxa-1和oxa-31的陽(yáng)性率均較低，分別只有16.2％、7.4％和10.6％。多數(shù)菌株攜帶有多種耐藥基因，一個(gè)菌株同時(shí)攜帶2種以上耐藥基因的有167株，占到了全部測(cè)試菌株的77.3％；最多的攜帶了7種被檢測(cè)的耐藥基因；大多數(shù)攜帶了3至5種耐藥基因，耐藥基因檢測(cè)全陰性

9、的只有20株，占全部被檢菌株不到10％。綜合耐藥基因檢測(cè)結(jié)果和耐藥性檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，耐藥基因檢出率的高低基本與相關(guān)藥物的耐藥率呈正相關(guān)。這為我們了解耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制以及進(jìn)一步進(jìn)行更大范圍的耐藥基因的分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 四、菌毛基因fimC和papC在禽致病性大腸桿菌中的流行病學(xué)研究菌毛是細(xì)菌的一種重要黏附因子，fimC和papC是大腸桿菌Ⅰ型菌毛和P菌毛的主要編碼基因。按菌毛基因fimC和papC參考序列，設(shè)計(jì)引物用

10、PCR方法分別擴(kuò)增497bp片段和500bp片段，并對(duì)菌株E.coli.NTCHC.05080108擴(kuò)增的fimC片段和E.coli.DTC.050315-1擴(kuò)增的papC片段進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，結(jié)果顯示與GenBank參考序列比較，同源性高達(dá)98％以上。用建立的PCR方法對(duì)本室分離鑒定保存的216株禽致病性大腸桿菌(APEC)進(jìn)行fimC和papC的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示93.5％的分離菌株攜帶有fimC，表明Ⅰ型菌毛在禽致病性大腸桿

11、菌中廣泛存在，而papC僅有14株檢測(cè)陽(yáng)性，占6.5％，其中有13株與Ⅰ型菌毛同時(shí)存在。結(jié)果提示我們，對(duì)于APEC來(lái)說(shuō)，Ⅰ型菌毛是其重要而且普遍存在的致病因子，而P菌毛在其致病作用中可能起到了輔助加強(qiáng)作用，兩者同時(shí)存在于同一菌株中對(duì)毒力的影響尚須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 五、耶爾森菌毒力島HPIirp2和fyuA基因在禽致病性大腸桿菌中的流行病學(xué)研究按耶爾森菌毒力島HPI結(jié)構(gòu)基因irp2和fyuA參考序列，設(shè)計(jì)引物用PCR方法分別擴(kuò)增4

12、13bp片段和774bp片段，并對(duì)E.coli.NTLFC040402等菌株擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank參考序列比較，同源性高達(dá)98％以上。用建立的PCR方法對(duì)本室分離鑒定保存的216株禽致病性大腸桿菌(APEC)進(jìn)行HPI的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示約44％的分離菌株攜帶有HPI毒力島，表明耶爾森菌毒力島HPI在禽源性大腸桿菌中廣泛存在，與血清型相結(jié)合分析，結(jié)果顯示分離菌株HPI與特定血清型具有相關(guān)性，對(duì)于O

13、78血清型菌株來(lái)說(shuō)，94.7％的分離菌株都攜帶HPI毒力島，O2、O24、O9和O93分別為66.7％、50％、27.3％和16.7％，而O88和O86都不攜帶該毒力島。 六、自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Vat、Tsh、溶血素E等九種毒力因子在禽致病性大腸桿菌中的流行病學(xué)研究采用PCR方法檢測(cè)216株禽致病性大腸桿菌(APEC)分離株另外9種毒力相關(guān)基因的流行情況。iucD基因的檢出率分別為70.8％，有近一半的檢測(cè)菌株擁有iss(58.8％)

14、和tsh(51.4％)基因，所有分離株都不含有eaeA基因。結(jié)合前兩章試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在所檢測(cè)的216株APEC中，只有4株分離菌不含有任何所檢測(cè)的毒力相關(guān)基因，19株分離菌只攜帶1種所檢測(cè)的毒力相關(guān)基因，多數(shù)菌株擁有2種以上毒力基因，其中有5株待測(cè)菌擁有10種毒力相關(guān)基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，hlyE基因主要在O78菌株中出現(xiàn)；35個(gè)分離株共同擁有fimC+iucD+irp2+fyuA+iss+colV+tsh+基因組合模式，其中18株O

15、78血清型菌株擁有該毒力基因組合模式。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)必將為今后更好地研究APEC的分類、揭示APEC的致病機(jī)理，進(jìn)而提出有效的防治措施提供重要的參考依據(jù)。 七、HPI-Irp1細(xì)胞表位作用初探通過(guò)生物軟件DNAStar的分析，篩選出irp1和fyuA基因上10個(gè)表位作用優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)的區(qū)域。設(shè)計(jì)特異性引物10對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物，插入原核表達(dá)載體pET32a，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌毛陰性宿主菌BL21