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文檔簡介
1、禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽類高死亡率給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來重大危害。存在于APEC中的PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是由菌體外膜蛋白PhoQ感應(yīng)外界環(huán)境變化,繼而將信號傳遞給PhoP,PhoP能夠調(diào)控病原菌毒力基因表達,這對菌體侵襲機體上皮細胞導(dǎo)致機體致病起著關(guān)鍵作用。探索PhoQ介導(dǎo)PhoP調(diào)控的APEC毒力基因靶點,針對APEC檢測受PhoP調(diào)控的外膜蛋白、內(nèi)毒素等
2、毒力相關(guān)基因,為后續(xù)進一步明確PhoP/Q調(diào)控系統(tǒng)對APEC毒力的影響奠定了基礎(chǔ)。
為探討由PhoQ介導(dǎo)的PhoP對毒力基因的調(diào)控作用,本實驗從基因調(diào)控角度入手通過禽致病性大腸桿菌phoP/Q基因的原核表達獲得其蛋白產(chǎn)物,檢測受PhoP蛋白調(diào)控的毒力相關(guān)基因;同時,得到了PhoQ蛋白為實驗室對PhoQ的研究提供了材料。本實驗為后續(xù)進一步研究PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌毒力的調(diào)控功能和作用機理提供一些參考。
3、 具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
1.禽致病性大腸桿菌PhoP/Q蛋白的表達
根據(jù)NCBI中報道的APEC phoP/Q基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號CP000468.1),分別設(shè)計phoP(5′、3′端分別添加EcoR I和Xho I酶切位點)和phoQ引物(5′、3′端分別添加EcoR I和Hind III酶切位點,本文中所提PhoQ均為膜外區(qū))用于擴增phoP/Q基因片段,將得到的phoP/Q基因片段克隆到PMD
4、19-T載體上,經(jīng)酶切和測序驗證后分別將PMD19-T-phoP/Q和pET32a進行雙酶切連接,成功構(gòu)建pET32a-phoP/Q原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。將測序正確的E.coli BL21(DE3)-pET32a-phoP/Q接種于LB液體培養(yǎng)基,IPTG誘導(dǎo)表達PhoP/Q重組蛋白,SDS-PAGE檢測分子量分別為42.9 KDa和34.43 KDa,與其理論分子量相一致。
2.禽致病性大腸桿菌Pho
5、P/Q蛋白的純化及鑒定
工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達,進一步證實重組的PhoP蛋白屬于胞內(nèi)可溶性表達,后期選擇30℃經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)過夜后離心取菌體沉淀,冰浴超聲破碎取上清過Ni-NTA親和層析柱純化PhoP蛋白,將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE和1D-LC-MS質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示成功表達PhoP重組蛋白。
PhoQ蛋白是一個經(jīng)過兩次跨膜的膜蛋白,前期全序列難以表達,后期選擇表達PhoQ蛋白的膜外功能區(qū)。
6、借鑒PhoP蛋白的表達純化方法,PhoQ條件摸索后確定為37℃0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)過夜后取LB上清進行純化,純化后經(jīng)過SDS-PAGE驗證最終得到PhoQ蛋白的胞外功能區(qū),為實驗室后續(xù)實驗做準備。3禽致病性大腸桿菌PhoP蛋白與毒力基因的相關(guān)性分析
在Genbank上查找目的基因啟動子區(qū)序列,通過生物信息學(xué)分析對PhoP蛋白與DNA的結(jié)合基序(啟動子區(qū))進行預(yù)測,利用凝膠遷移實驗(EMSA)驗證PhoP蛋白能夠結(jié)
7、合的基因啟動子,最終檢測出可能受PhoP調(diào)控的宿主菌外膜蛋白、內(nèi)毒素等毒力相關(guān)基因分別為iss血清毒力基因、mgtA鎂離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、chuA外膜血紅蛋白受體基因、uspA應(yīng)激反應(yīng)基因、slyB外膜脂蛋白基因、hlyF溶血基因。
本實驗成功構(gòu)建了pET32a-phoP/Q表達載體,分別獲得胞內(nèi)可溶性PhoP蛋白和分泌型表達PhoQ蛋白的工程菌,并利用凝膠遷移實驗驗證了表達的PhoP重組蛋白具有選擇結(jié)合基因啟動子的活性,建立了
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