禽致病性大腸桿菌PhoP-Q調(diào)控的毒力基因及腸道感染應(yīng)答基因的篩選.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)的毒力因子致病性復(fù)雜。其可通過內(nèi)毒素（LPS）損傷雞腸道，破壞上皮組織，誘導(dǎo)應(yīng)答基因的防御性表達(dá)，而應(yīng)答基因的表達(dá)水平與APEC的自身致病力有很大關(guān)系。PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌中調(diào)控細(xì)菌毒力和許多細(xì)胞活性的信號傳導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)，有關(guān)研究表明PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)在調(diào)控APEC致病力方面發(fā)揮著重要作用。
　　本實

2、驗研究了PhoP/Q基因缺失對禽致病性大腸桿菌生物學(xué)特性及毒力的影響，并應(yīng)用基因芯片從轉(zhuǎn)錄水平比較野生株和缺失株的基因表達(dá)差異，篩選PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)可能調(diào)控的毒力基因，同時采用高通量RNA-Seq技術(shù)篩選出APEC與PhoP/Q基因缺失株感染雛雞小腸后的應(yīng)答基因，進(jìn)一步揭示了PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)與APEC致病力之間的關(guān)系。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、禽致病性大腸桿菌PhoP/Q基因缺失對其生物學(xué)特性及毒力的影響<

3、br>　　本研究分別通過菌體超微結(jié)構(gòu)的觀察實驗、過氧化氫敏感性實驗、血清殺菌學(xué)實驗和組織載菌量實驗探索PhoP/Q基因缺失對APEC生物學(xué)特性和毒力的影響。結(jié)果表明，缺失 PhoP/Q基因影響細(xì)菌菌毛的表達(dá)，但在過氧化氫敏感性實驗和雞血清的補(bǔ)體殺菌實驗中無明顯差異。組織載菌量實驗結(jié)果顯示，AE17在感染雛雞的肝和脾的細(xì)菌載菌量分別為1.72×107 CFU/g和2.23×107 CFU/g。然而，在PhoP/Q缺失株中肝和脾的細(xì)菌載菌量

4、分別為1.37×105 CFU/g和4.23×106 CFU/g，與野生株相比PhoP/Q缺失株在肝脾中的載菌量減少。
　　2、運(yùn)用基因芯片篩選禽致病性大腸桿菌PhoP/Q調(diào)控的毒力基因
　　為探索PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)可能調(diào)控的毒力基因。應(yīng)用基因芯片技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄水平比較野生株和缺失株之間差異基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，與野生株相比，PhoP、PhoQ和PhoP/Q基因敲除株三株共同變化的差異基因共292個，其中170個上調(diào)，

5、122個下調(diào)，GO（Gene Ontology）分類結(jié)果顯示，這些基因主要參與包括生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、新陳代謝過程、細(xì)胞部分膜、結(jié)合、催化活性、電子載體活動、酶調(diào)節(jié)活動、受體活動、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活動和轉(zhuǎn)運(yùn)活動。通過實時熒光定量PCR技術(shù)對其中7個差異基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測，結(jié)果與表達(dá)譜芯片一致。
　　3、RNA-Seq篩選APEC和PhoP/Q缺失株感染雛雞腸道的應(yīng)答基因
　　為篩選AE17菌株與PhoP/Q缺失株感染雛

6、雞小腸差異表達(dá)的免疫應(yīng)答基因，應(yīng)用高通量RNA-Seq技術(shù)篩選出AE17與PhoP/Q缺失株感染雛雞小腸后的差異表達(dá)基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)GO功能分類和KEGG信號通路分析，并利用熒光定量PCR驗證了部分差異表達(dá)基因。野生株攻毒組與對照組相比篩選出的差異表達(dá)基因共有131個差異基因，其中上調(diào)的差異基因有74個，下調(diào)的差異基因有57個。GO分類結(jié)果顯示，這些基因主要涉及到蛋白結(jié)合、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)活動等功能。KEGG分析這些差異表達(dá)基因參與

7、PPAR、新陳代謝、細(xì)胞因子受體相互作用，Jak-STAT、RIG-I-樣受體和吞噬體等信號通路。缺失株攻毒組與對照組相比篩選出的差異表達(dá)基因共有172個，其中上調(diào)的差異基因有93個，下調(diào)的差異基因有79個。GO分類結(jié)果顯示，這些基因主要涉及到氧化還原活動、轉(zhuǎn)運(yùn)活動、新陳代謝過程、免疫反應(yīng)等功能。KEGG分析這些差異表達(dá)基因參與MAPK信號通路、粘著斑、PPAR、吞噬體和新陳代謝通路等。
　　以上研究結(jié)果表明，PhoP/Q基因缺失

8、影響禽致病性大腸桿菌菌毛的表達(dá)并降低肝脾的載菌量，表明二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP/Q在 APEC毒力作用中扮演重要角色。繼而通過基因芯片分析 PhoP/Q基因缺失引起的差異表達(dá)基因，結(jié)合生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)報道，篩選出crcA、ompT、yrbL、ybjx、rstA、rstB、fliA、hslJ和degP等二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP/Q可能直接調(diào)控的毒力基因。應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)篩選APEC與 PhoP/Q缺失株感染雛雞腸道后的差異表達(dá)的基因，篩