LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達及調控相關研究及其多克隆抗體制備.pdf

1、第一部分LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達及調控 目的：①建立子宮內(nèi)膜癌組織LRP16基因mRNA的提取方法；②初步研究子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常子宮內(nèi)膜組織的LRP16基因表達特點，為進一步分析LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過程中的變化特點意義奠定基礎。 方法：收集子宮內(nèi)膜癌手術切除的新鮮組織標本和部分臨床病理診斷資料，采用Northern Blot方法檢測子宮內(nèi)膜癌及癌旁臨床組織標本的LRP16基因mRNA的表達水平。

2、 結果：①成功建立子宮內(nèi)膜癌組織提取LRP16基因的方法。②以β-actin為內(nèi)參照，6例子宮內(nèi)膜癌組織標本中有2例LRP16 mRNA表達較癌旁正常子宮內(nèi)膜組織明顯增高。 結論：①LRP16基因作為組成基因在子宮內(nèi)膜組織中均有表達。②子宮內(nèi)膜癌患者中，1/3患者存在LRP16 mRNA過表達，提示LRP16基因可能在子宮內(nèi)膜癌組織中存在過表達。 第二部分 LRP16基因的多克隆抗體制備及初步應用 目的：

3、制備兔抗人LRP16蛋白多克隆抗體，并利用該抗體檢測LRP16蛋白的在不同組織中的分布特點及亞細胞定位，初步分析LRP16蛋白在女性生殖系統(tǒng)正常組織及腫瘤組織中的表達特點，以及與雌激素受體表達的相關性。 方法：采用RT-PcR方法提取正常人外周血LRP16基因，采用PCR方法擴增后，與PT-Adv載體連接，表達產(chǎn)物提取質粒，測序無誤后進行雙酶切，重新連接LRP16基因和原核表達載體pRSET-C，連接產(chǎn)物轉化BL21(DE3)缺

4、陷型大腸桿菌。誘導該基因原核表達，快速蛋白免疫法免疫新西蘭長毛兔，ELISA法監(jiān)測抗體效價，獲取抗LRP16基因的多克隆抗體。利用Western blot方法檢測該抗體在不同LRP16基因抑制率的乳腺癌系MCF-7的結合效率，評價該多克隆抗體的免疫學活性及免疫學特異性。采用免疫組化法觀察LRP16基因產(chǎn)物在女性子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的正常組織和腫瘤組織中的表達差異。 結果：成功獲得高效的LRP16多克隆抗體，該

5、多克隆抗體具備良好的免疫學活性及特異性。利用該抗體初步證實LRP16基因編碼產(chǎn)物主要在細胞漿和細胞核中表達，且以上皮細胞為主。LRP16蛋白表達與雌激素受體表達可能存在正相關。 結論：制備的LRP16抗體及其全長基因可用于LRP16基因的生理功能及病理學研究，LRP16基因主要在生長活躍的細胞，尤其是上皮細胞中表達。初步發(fā)現(xiàn)LRP16基因的表達與雌激素受體呈正相關。 第三部分 LRP16通過ERα介導抑制了Ishikaw

6、a細胞中E-鈣黏著素的轉錄活性 目的：既往研究表明LRP16基因過表達通過下調E-鈣黏著素蛋白(E-cadherin)促進子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的侵襲生長，本研究目的在于探討LRP16下調E-cadherin的分子途徑。 方法：免疫組化方法檢測LRP16基因表達Ishikawa細胞中E-cadherin的表達；共轉染與熒光素酶實驗檢測LRP16基因對E-cadherin啟動子轉錄活性的影響；染色質免疫共沉淀實驗檢

7、測雌激素受體α(ERα)與LRP16在E-cadherin啟動子區(qū)的招募狀況。 結果：E-cadherin在LRP16過表達的Ishikawa細胞中的表達水平明顯下調；LRP16抑制了E-cadherin啟動子的轉錄活性，該效應呈現(xiàn)對雌激素(E2)存在的依賴性特征；LRP16本身沒有與E-cadherin啟動子區(qū)結合，但明顯抑制了ERα與E-cadherin啟動子區(qū)的結合。 結論：LRP16通過抑制ERα對E-cadhe