慢病毒介導(dǎo)RNA干擾NgR基因?qū)顾钃p傷的修復(fù)作用.pdf

1、目的： 1．設(shè)計(jì)、構(gòu)建攜帶siNgR199慢病毒重組體。 2．在細(xì)胞水平探討慢病毒重組體沉默NgR基因的效應(yīng)及最佳給藥劑量。 3．在動(dòng)物模型水平探討慢病毒重組體沉默NgR基因?qū)Υ笫骃CI后神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)功能的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。 方法： 1．按照Elbashir等設(shè)計(jì)原則和siRNA表達(dá)載體的要求，設(shè)計(jì)構(gòu)建NgR特異siNgR199慢病毒重組體，并進(jìn)行酶切鑒定及基因測(cè)序；

2、 2．體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞，1周后進(jìn)行不同滴度的重組慢病毒轉(zhuǎn)染，通過(guò)熒光鏡觀察重組體轉(zhuǎn)染情況，確定最適轉(zhuǎn)染的慢病毒重組體MOI值，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)源性Nga基因沉默效果； 3．采用改良Allen’s打擊法建立大鼠中度脊髓損傷模型； 4．36只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、空慢病毒組、重組慢病毒組(各12只)，脊髓損傷后1周行皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)多點(diǎn)注射給藥，給藥8d后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢

3、測(cè)注謝區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞NgR mRNA表達(dá)情況，免疫組化觀察NgR蛋白表達(dá)狀況。 5．36只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為生鹽水組、空慢病毒組、重組慢病毒組(各12只)，脊髓損傷后1周行皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)多點(diǎn)注射，在脊髓損傷后每周，對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分；給藥后6周行皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)注射神經(jīng)示蹤劑，給藥后8周通過(guò)組織學(xué)觀察脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)情況。 結(jié)果： 1．構(gòu)建的NgR特異性siNgR199慢病毒重組體經(jīng)酶切鑒定、基

4、因測(cè)序儀測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符，目的基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤，慢病毒重組體構(gòu)建成功。 2．慢病毒重組體實(shí)現(xiàn)大鼠原代皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染，96h后神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)綠色熒光，146h后綠色熒光最強(qiáng)，適合高效感染的MOI值為3；轉(zhuǎn)染192h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示目的基因抑制效率為61％，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3.在改良Allen's大鼠脊髓損傷模型中行皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)分點(diǎn)注射給藥，給藥8

5、d后取注射區(qū)腦組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查NgR表達(dá)水平，結(jié)果顯示，重組慢病毒注射組與生理鹽水注射組及空慢病毒注射組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；注射區(qū)腦組織切片進(jìn)行免疫組化檢查NgR蛋白表達(dá)情況，生理鹽水組及空慢病毒組可見(jiàn)清晰陽(yáng)性細(xì)胞，重組慢病毒組NgR染色陽(yáng)性顆粒減少，從而說(shuō)明在活體內(nèi)大腦皮層注射慢病毒重組體轉(zhuǎn)染后實(shí)現(xiàn)了NgR基因的沉默。 4.大鼠脊髓損傷后每周行BBB評(píng)分，所有實(shí)驗(yàn)大鼠在損傷后第1天都表現(xiàn)為喪失所有后

6、肢運(yùn)動(dòng)，BBB評(píng)分均為O分，但損傷后1周內(nèi)未給藥情況下可自然恢復(fù)至BBB評(píng)分平均為8分水平，損傷后3周內(nèi)恢復(fù)的幅度較大，損傷3周后(給藥2周后)恢復(fù)減慢，但損傷5周后(給藥4周后)重組慢病毒組恢復(fù)情況明顯好于空慢病毒組及生理鹽水組；雖然各實(shí)驗(yàn)組SCI大鼠的神經(jīng)功能均有一定程度的神經(jīng)恢復(fù)，但重組慢病毒組和生理鹽水組及空慢病毒組之間神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果差異顯著(P<0.01)，生理鹽水組和空慢病毒組之間神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果無(wú)明顯差異(P>0.05)

7、。組織學(xué)和神經(jīng)纖維染色檢查結(jié)果：重組慢病毒組損傷部位形成的空洞比較少，可觀察到神經(jīng)纖維通過(guò)、有更多髓鞘組織形成及膠質(zhì)細(xì)胞增生；神經(jīng)示蹤觀察重組慢病毒組有少量的軸突生長(zhǎng)通過(guò)損傷區(qū)域。 結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建了NgR特異性siNgR199慢病毒重組體，重組體能夠在大鼠體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元和體內(nèi)脊髓損傷模型中實(shí)現(xiàn)RNA干擾，較長(zhǎng)時(shí)間下調(diào)神經(jīng)元的內(nèi)源性NgRmRNA表達(dá)，并在一定程度上促進(jìn)脊髓神經(jīng)軸突再生和大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的