西洋參皂苷對(duì)缺氧性大腦皮層神經(jīng)元壞死及凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察西洋參皂苷對(duì)缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)后胎鼠大腦皮層神經(jīng)元壞死和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、離體培養(yǎng)胎鼠大腦皮層神經(jīng)元6d，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)NSE及GFAP表達(dá)率；
　　 2、MTT法檢測(cè)不同濃度組西洋參皂苷對(duì)神經(jīng)元活力的影響；
　　 3、神經(jīng)元離體有氧培養(yǎng)4d，經(jīng)缺氧12h復(fù)氧48h培養(yǎng)建立缺氧-復(fù)氧損傷凋亡模型；
　　 4、Trypan blue

2、拒染法檢測(cè)不同缺氧時(shí)間(6h，12h，24h)對(duì)神經(jīng)元存活率影響；
　　 5、實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組：正常有氧培養(yǎng)；陽(yáng)性對(duì)照(凋亡誘導(dǎo))組：正常培養(yǎng)4d后行缺氧12h復(fù)氧48h培養(yǎng)；藥物組：正常培養(yǎng)4d后分別加入終濃度為0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷預(yù)處理4h，余同陽(yáng)性對(duì)照組；
　　 6、MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元活力；
　　 7、Annexin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀定量分

3、析各實(shí)驗(yàn)組凋亡率及壞死率；
　　 8、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組抗凋亡蛋白Bcl-2及凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)率；
　　 9、DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組DNA梯度凋亡條帶；
　　 10、Hoechst33342熒光染色法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮層神經(jīng)元6d，NSE表達(dá)率為(92.8±0.35)％，GFAP表達(dá)率為(5.9±0.32)

4、％；
　　 2、MTT法檢測(cè)結(jié)果示：0.025-0.2mg/ml西洋參皂苷可提高神經(jīng)元活力，與正常對(duì)照組(0.45±0.027)比較，0.05mg/ml(0.494±0.011)、0.1mg/ml(0.535±0.022)組有明顯增殖作用(P<0.01)，而0.4mg/ml(0.243±0.022)、0.8mg/ml(0.082±0.007)組則表現(xiàn)出明顯藥物毒性作用(P<0.01)；
　　 3、Trypan blue拒

5、染法結(jié)果示：缺氧6h、12h、24h，復(fù)氧48h神經(jīng)元存活率分別為(87.87±3.04)％、(66.80±3.82)％、(28.03±4.45)％。除6h組外，12h及24h組細(xì)胞存活率均較正常對(duì)照組(92.40±3.24)％明顯降低(P<0.01)；
　　 4、MTT法檢測(cè)結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組(0.324±0.023)細(xì)胞活力比正常對(duì)照組(0.488±0.030)明顯降低(P<0.01)。0.025-0.2mg/ml西洋參皂苷

6、對(duì)凋亡誘導(dǎo)神經(jīng)元活力有改善作用，除0.025mg/ml(0.371±0.074)組外，0.05mg/ml(0.425±0.024)、0.1mg/ml(0.446±0.050)組神經(jīng)元活力均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；
　　 5、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組凋亡率(28.77±0.50)％較正常對(duì)照組(2.05±0.13)％明顯升高(P<0.01)。0.025、0.05、0.1、

7、0.2mg/ml西洋參皂苷組凋亡率分別為(14.47±0.49)％、(9.43±0.10)％、(6.13±0.68)％、(10.85±0.25)％，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組(6.57±0.19)％壞死率較正常對(duì)照組(0.84±0.08)％明顯升高(P<0.01)。0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組壞死率分別為(5.47±0.18)％、(2.15±0.13)％、(2.52±0.07)％、(

8、2.4±0.10)％，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；
　　 6、抗凋亡蛋白Bcl-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組(35.61±2.16)％Bcl-2蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組(67.65±4.32)％明顯降低(P<0.01)。0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組Bcl-2蛋白表分別為(44.22±3.73)％、(51.97±1.86)％、(63.76±2.96)％、(58.46±0.71)％，均較

9、陽(yáng)性對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；
　　 7、凋亡蛋白Bax免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組(72.19±3.97)％Bax蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組(60.33±2.06)％明顯升高(P<0.01)。0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組Bax蛋白表達(dá)分別為(62.94±1.68)％、(57.97±2.6))％、(60.27±1.26)％，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；
　　 8、凋亡蛋白Caspase

10、-3免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組(68.62±1.40)％Caspase-3蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組(40.86±1.44)％明顯升高(P<0.01)。0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組Caspase-3蛋白表達(dá)分別為(56.41±2.87)％、(50.34±2.65)％、(56.52±4.30)％，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；
　　 9、Bcl-2/Bax結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照組(0.56±0.11)Bcl-

11、2/Bax比值較正常對(duì)照組(1.12±0.04)比較明顯降低(P<0.01)。0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組Bcl-2/Bax比值分別為(0.85±0.05)、(1.11±0.04)、(0.98±0.03)，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；
　　 10、DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組和0.025mg/ml西洋參皂苷組可見(jiàn)有明顯凋亡梯狀條帶，而正常對(duì)照組、0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷

12、組均未見(jiàn)明顯凋亡梯狀條帶；
　　 11、Hoechst33342熒光染色結(jié)果示：陽(yáng)性對(duì)照組(39.47±0.92)％凋亡率較正常對(duì)照組(8.51±0.68)％明顯升高(P<0.01)。0.025、0.05、0.1、0.2mg/ml西洋參皂苷組凋亡率分別為(29.91±1.06)％、(25.37±0.47)％、(16.07±0.71)％、(19.09±1.06)％，均較陽(yáng)性對(duì)照組明顯下降(P<0.01)；
　　 結(jié)論：

13、r>　　 1、體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧12h，復(fù)氧48h誘導(dǎo)后能成功建立神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型
　　 2、西洋參皂苷在0.025mg/ml～0.2mg/ml濃度范圍內(nèi)能有效抑制缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞壞死與凋亡，其抗凋亡機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2及下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)，進(jìn)而提高神經(jīng)細(xì)胞的缺氧耐受性，逆轉(zhuǎn)缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且濃度為0.05-0.1mg/ml時(shí)西洋參皂苷具有最佳