家兔卵巢組織冷凍保存、體外培養(yǎng)及移植的研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：
　　 觀察4種冷凍復蘇方法對家兔卵巢組織形態(tài)學及卵母細胞PCNA表達的影響，探討適宜的卵巢組織冷凍復蘇方案。
　　 方法：
　　 將12只健康日本大耳白家兔隨機分為4組，分別采用PROH及DMSO慢速程序化冷凍和DMSO+PROH及DMSO+EG玻璃化冷凍方法凍存家兔卵巢組織，液氮保存一月后復蘇，分別行HE染色及免疫組化染色，觀察冷凍復蘇后卵巢組織結構和各級卵泡形態(tài)學的改變及始基

2、和初級卵泡卵母細胞PCNA表達的變化。
　　 結果：
　　 1.各冷凍組合并后計算始基卵泡的形態(tài)正常率為72.70[％]，初級卵泡的形態(tài)正常率為52.77[％]，二者比較，差異有顯著性。4個冷凍組均可見卵巢組織結構受損的表現(xiàn)，鏡下可見部分卵泡與周圍間質細胞分離，間質細胞連接變得疏松，排裂紊亂，有裂隙形成。
　　 2.免疫組化染色結果顯示冷凍組中PROH組始基及初級卵泡卵母細胞PCNA的陽性率最高達，玻璃化組2次之

3、，與新鮮對照組比較差異無顯著性，而DMSO組及玻璃化組1PCNA陽性率較新鮮對照組明顯降低。
　　 結論：
　　 1.4種冷凍復蘇方法均對家兔卵巢組織結構造成一定程度的損傷，使各級卵泡的形態(tài)正常率明顯下降，出現(xiàn)間質受損的表現(xiàn)。
　　 2.PROH慢速程序化冷凍法明顯優(yōu)于DMSO慢速程序化法及玻璃化法，較適合卵巢組織中始基卵泡的保存。
　　 3.凍存卵巢組織對初級卵泡的影響大于始基卵泡。
　　 4.

4、PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化冷凍能較好地保持家兔卵巢組織中始基及初級卵泡卵母細胞的增殖活性。
　　 第二部分:
　　 目的：
　　 觀察PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化冷凍對家兔卵巢組織超微結構、ER和MHC-Ⅱ類抗原表達及卵泡細胞增殖活性的影響，判斷復蘇后卵巢組織抗原性和免疫原性是否發(fā)生改變，為今后卵巢組織移植及體外培養(yǎng)的研究奠定基礎。
　　 方法：
　　 1、將健康

5、日本大耳白家兔9只隨機分為3組，1組為新鮮對照組，另2組為冷凍組。冷凍組分別采用PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化凍存方案凍存家兔卵巢組織。
　　 2、復蘇后透射電鏡觀察兩種冷凍方法對家兔卵巢組織超微結構的影響。
　　 3、SP免疫組化法觀察兩種方法對家兔卵巢組織ER及MHC-Ⅱ類抗原表達的影響。
　　 4、機械性分離新鮮組及冷凍組復蘇的組織塊，分離下的卵泡按直徑的大小，有5層以上顆粒細胞包裹的大次級卵

6、泡。每組分別取20個形態(tài)正常的OGC，行3H標記的胸腺嘧啶核苷摻入試驗。
　　 結果：
　　 1、PROH組始基卵泡卵母細胞部分線粒體腫脹，呈空泡狀；部分線粒體形態(tài)尚正常；細胞核形態(tài)正常，核膜完整，界線清晰；顆粒細胞核膜完整，胞質內線粒體形態(tài)正常,細胞間縫隙連接完好。DMSO+EG組，始基卵泡卵母細胞線粒體腫脹，細胞器崩解；細胞形態(tài)尚可，邊界清晰，核膜完整。周圍顆粒細胞內線粒體尚可，間質細胞線粒體腫脹明顯，呈空泡狀。

7、r>　　 2、免疫組化結果顯示，兩冷凍組復蘇后家兔卵巢組織ER的表達與新鮮對照組比較，無明顯變化。DMSO+EG玻璃化冷凍組MHC—Ⅱ類抗原的表達與新鮮對照組比較明顯下降，PROH組無明顯變化。
　　 3、兩冷凍組復蘇后小OGC的cpm值與新鮮對照組比較，無明顯差異，而大OGC的cpm值較新鮮對照組明顯下降。
　　 結論：
　　 1.PROH慢速程序化冷凍對家兔卵巢組織超微結構的影響小于DMSO+EG玻璃化冷凍

8、。
　　 2.兩種冷凍復蘇方法，對家兔卵巢組織ER的表達均無明顯影響。
　　 3.DMSO+EG玻璃化冷凍復蘇明顯降低了卵巢組織的免疫原性。
　　 4.兩種冷凍復蘇方法對形態(tài)結構完整的小OGC增殖活力無明顯影響，這些卵泡體外生長和成熟，可能更容易成功。多層顆粒細胞包裹的大OGC即便形態(tài)正常，其增殖活性也明顯受到抑制。
　　 第三部分:
　　 目的：
　　 探討適宜的卵巢組織體外培養(yǎng)方法。<

9、br>　　 方法：
　　 1.無菌條件下取新鮮家兔卵巢組織，復蘇PROH慢速程序化冷凍保存的家兔卵巢組織，分別采用部分分離培養(yǎng)及組織塊培養(yǎng)方法體外連續(xù)培養(yǎng)14d，作為新鮮部分分離培養(yǎng)組、新鮮組織塊培養(yǎng)組、冷凍部分分離培養(yǎng)組、冷凍組織塊培養(yǎng)組。
　　 2.每隔1天倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)情況，并收集組織培養(yǎng)液500μl待測E2，同時補入新鮮培養(yǎng)液500μl。采用酶免法檢測各組E2分泌量的變化。
　　 培養(yǎng)14d結束時

10、機械性分離各組卵巢組織，將形態(tài)結構完整，顆粒細胞連續(xù)，折光性好的大OGC和小OGC每組分別各取20個，進行3H標記的胸腺嘧啶核苷摻入試驗。
　　 結果：
　　 1.倒置顯微鏡下新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組均可見單層顆粒細胞包裹的小卵泡，連續(xù)培養(yǎng)14d，未見明顯生長，卵泡內出現(xiàn)黑色顆粒，有退化壞死的跡象。
　　 2.新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組，培養(yǎng)14d后機械性分離卵巢組織均可見竇卵泡形成，進一步分離得到GV期卵子，未得

11、到MⅡ期卵子。
　　 3.新鮮及冷凍組織塊培養(yǎng)組，14d培養(yǎng)結束時未見到有明顯竇腔的卵泡形成。
　　 4.各培養(yǎng)組E2分泌量的變化：
　　 新鮮組織塊組，第6天E2分泌量達高峰，第8天開始逐漸下降；冷凍組織塊組E2分泌量持續(xù)下降；而新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組E2分泌持續(xù)上升。
　　 5.3H標記胸腺嘧啶核苷摻入試驗結果：新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組和新鮮組織塊組所得到的小OGC其cpm值均無明顯差異，而冷凍組織

12、塊得到小OGC的cpm值較以上各組明顯降低。
　　 6.冷凍組織塊組培養(yǎng)結束時，未得到形態(tài)正常的大OGC。新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)所得到的形態(tài)正常的大OGC其cpm值無明顯差異，而新鮮組織塊組所得到的大OGC的cpm值較上兩組明顯下降。
　　 結論：
　　 1.部分分離法體外培養(yǎng)新鮮及冷凍的家兔卵巢組織明顯優(yōu)于組織塊培養(yǎng)法。體外培養(yǎng)14d，前者培養(yǎng)液中E2呈上升趨勢，有竇卵泡形成；后者隨培養(yǎng)時間的延長E2呈下降趨勢

13、，未見竇卵泡形成。
　　 2.新鮮及冷凍組織部分分離培養(yǎng)所得到的形態(tài)正常的大小OGC均有良好的增殖活性，說明PROH慢速程序化冷凍較好地保存了存活卵泡的體外發(fā)育潛能。
　　 3.該培養(yǎng)系統(tǒng)不適合家兔卵巢組織始基及初級卵泡的體外培養(yǎng)。
　　 4.冷凍卵巢組織更不適合組織塊培養(yǎng)，所得到的形態(tài)正常的小OGC增殖活性差，未得到形態(tài)正常的大OGC。
　　 第四部分:
　　 目的：
　　 探討適宜的卵

14、巢組織移植部位，觀察移植成活物的生理功能。
　　 方法：
　　 1.選健康大耳白家兔20只隨機分為對照組、去勢組、移植組。
　　 2.移植組選宮旁闊韌帶為移植部位，將切下的雙側卵巢去除髓質，切成1×1×1mm3大小的組織塊植入左側闊韌帶的漿膜下，移植術后隔日肌注HMG 10IU/天，至術后半月。去勢組切除雙側卵巢。
　　 3.術后第2天開始隔日行陰道脫落細胞學涂片，觀察雌激素水平的變化，至術后一個半月。<

15、br>　　 4.術后一月開始，每只家兔每隔5日，連續(xù)3次取耳緣靜脈血2ml，酶免法測定血清E2水平。
　　 5.術后1個半月再次開腹，取對照組子宮內膜及卵巢；取去勢組子宮內膜；取移植組的成活移植物及子宮內膜，做HE染色行組織形態(tài)學觀察。
　　 6.移植成活的卵巢組織及對照組卵巢組織行SP免疫組化染色，觀察PCNA及VEGF表達的變化。
　　 結果：
　　 1.陰道脫落細胞學涂片結果：對照組陰道細胞涂片顯

16、示細胞大，為多邊型，胞漿稀薄透明，核小固縮，為雌激素作用的表現(xiàn)；去勢組術后4—6天開始，陰道細胞涂片顯示細胞呈圓形，核大圓形或橢圓形，核漿比增加，為低雌激素水平的表現(xiàn)；移植組1只術后死亡，剩余家兔術后4—6天開始陰道細胞涂片顯示低雌激素水平，7只家兔術后10—20天重新恢復雌激素作用的表現(xiàn)，另2只未恢復。
　　 2.E2測定結果：移植組7只家兔術后1個月血清E2水平恢復正常，與正常對照組比較，差異無顯著性；另2只家兔E2未恢復正

17、常。去勢組家兔E2水平明顯降低，與對照組比較，差異有顯著性。
　　 3.HE染色子宮內膜形態(tài)學觀察：去勢組：子宮內膜上皮細胞由單層柱狀細胞組成，腺體數(shù)量少，形態(tài)萎縮，間質細胞排裂緊密。移植組：E2水平恢復的7只家兔，子宮內膜表層細胞呈鋸齒狀，由假復層柱狀細胞構成，腺體數(shù)量多，排列緊密，形態(tài)飽滿，間質細胞排列疏松，同對照組；另2只E2低水平的家兔子宮內膜同去勢組。
　　 4.移植組卵巢組織形態(tài)學觀察：移植組6只闊韌帶處找到

18、成活的卵巢組織，外觀見移植的卵巢組織被纖維組織及脂肪組織包裹，HE染色鏡下可見形態(tài)正常的各級卵泡及大量新生血管。
　　 5.免疫組化結果：移植組卵巢組織始基及初級卵泡卵母細胞PCNA表達陽性率為78.67[％]與對照組比較無明顯差異，VEGF的表達部位及表達強度與對照組比較也無明顯差異。
　　 結論：
　　 1.子宮旁闊韌帶處血供豐富，內環(huán)境接近卵巢生理狀態(tài)，移植手術操作簡便，較適合卵巢組織移植，結合移植術后應用