人體大塊卵巢組織玻璃化冷凍及異種移植研究.pdf

1、背景及目的：
　　近年來(lái)越來(lái)越多的惡性腫瘤患者受益于醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及進(jìn)步，與此同時(shí)全身化療及放療帶來(lái)的弊端也日益顯現(xiàn)。年輕女性患者在接受大劑量化學(xué)藥物治療或放療的同時(shí)，性腺器官受損導(dǎo)致的功能衰竭或喪失等問(wèn)題也隨之而來(lái)。隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的追求越來(lái)越高，越來(lái)越多的腫瘤患者迫切的希望能夠在抗腫瘤治療前保存生殖功能。卵巢組織的冷凍保存是保存女性生殖功能的方法之一，較為常用的是經(jīng)典的慢速程序化冷凍方案，但程序化冷凍需配備要求較高的儀器設(shè)備

2、，費(fèi)用昂貴，同時(shí)在細(xì)胞保存方面存在一定弊端。隨著冷凍技術(shù)的逐步提高，玻璃化冷凍技術(shù)成為近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的冷凍方法。
　　玻璃化冷凍技術(shù)將細(xì)胞或組織等直接投入液氮中，通過(guò)快速的降溫速率，可以繞開(kāi)組織內(nèi)不同細(xì)胞成分對(duì)慢速冷凍參數(shù)要求不同的技術(shù)障礙，形成一種玻璃化狀態(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，減少對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，從而提高冷凍保存效果。然而相較于卵子、胚胎的玻璃化冷凍及卵巢組織的程序化冷凍，卵巢組織玻璃化冷凍方案仍被認(rèn)為處于不成熟的實(shí)驗(yàn)性

3、階段，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)人卵巢組織經(jīng)玻璃化冷凍并移植后獲得成功妊娠的報(bào)道，而經(jīng)程序化冷凍并移植已見(jiàn)活產(chǎn)報(bào)道。
　　目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的卵巢組織玻璃冷凍方案，但大多數(shù)研究中所使用的卵巢組織薄片均選擇凍存小塊卵巢組織(面積<1cm2，厚度1mm)，原因可能是為了使冷凍保護(hù)劑更容易滲透。但卵巢組織過(guò)小，存在一定弊端，一方面切割過(guò)程中容易形成較多廢棄組織，而通過(guò)冷凍大塊的卵巢組織能獲取更多的卵泡，并且組織內(nèi)結(jié)構(gòu)能更好地支持卵泡生長(zhǎng)，另一方面卵巢組

4、織在凍存過(guò)程及移植后血管再生過(guò)程中存在丟失大量卵泡的缺點(diǎn)?；谏鲜鲈?，凍存小塊卵巢皮質(zhì)組織并進(jìn)行移植的生殖力保存效果將明顯降低。
　　從理論上講，凍存一定數(shù)量的卵泡對(duì)于卵巢功能的維持及女性生殖能力的保護(hù)是有益的，對(duì)于即將接受具有明顯毒副作用大劑量放化療的女性惡性腫瘤患者來(lái)說(shuō)更是如此。雖然目前應(yīng)用玻璃化方法凍存人卵巢組織的研究已有陸續(xù)報(bào)道，卻鮮少見(jiàn)關(guān)于人體大塊卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍的報(bào)道。
　　本研究通過(guò)改進(jìn)卵巢組織薄片的切

5、割方法調(diào)整玻璃化冷凍方案對(duì)人體大塊卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍，并與程序化冷凍方案的凍存效果進(jìn)行比較，在解凍后進(jìn)行組織學(xué)分析并采用DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)進(jìn)行凋亡檢測(cè)，并將卵巢組織在解凍后移植至免疫缺陷的裸鼠皮下，3周后取出，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67抗原的表達(dá)情況評(píng)估移植后卵泡活性,以探討人體大塊卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍的可行性。
　　材料與方法：
　　收集2013年12月-2015年9月期間鄭州大學(xué)第一附屬

6、醫(yī)院婦科行腹腔鏡下或開(kāi)腹手術(shù)切除卵巢的18例人體卵巢組織，每例標(biāo)本修剪成3片大塊卵巢皮質(zhì)薄片（1mm(厚)×10mm（寬）×18mm（長(zhǎng)）），將組織薄片隨機(jī)分為三組：玻璃化冷凍組（A組），程序化冷凍組（B組），新鮮對(duì)照組（C組），對(duì)各組卵巢組織進(jìn)行HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析及TUNEL染色進(jìn)行凋亡檢測(cè)，在進(jìn)行裸鼠異種移植后3周回收卵巢組織片計(jì)算卵泡密度檢測(cè)卵泡保存情況，并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67抗原的表達(dá)情況評(píng)估卵泡活性。
　　

7、結(jié)果：
　?。?）解凍后的A組形態(tài)正常的始基卵泡比例（79.6％）與B組（74.5%）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；
　?。?）各冷凍組卵泡凋亡發(fā)生率明顯高于新鮮對(duì)照組，但A、B組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。間質(zhì)細(xì)胞凋亡率A組低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　?。?）移植后各組卵泡密度無(wú)明顯差異；Ki-67抗原在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞均有散在表達(dá)，卵泡陽(yáng)性率A組與B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)