急性肝壞死時(shí)腸道SIgA變化機(jī)制的研究.pdf

1、目的：腸屏障可防止腸道內(nèi)寄生菌、毒素等經(jīng)腸壁到達(dá)腸外，它由腸道機(jī)械屏障、微生物屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障組成。腸道免疫屏障主要由腸道M細(xì)胞、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(iIEL)、固有層淋巴細(xì)胞、分泌性IgA(SIgA)等組成。SIgA通過抑制細(xì)菌或病毒黏附在腸上皮表面，阻止細(xì)菌穿入腸道屏障。因此，腸道內(nèi)SIgA存在狀態(tài)影響腸道免疫屏障功能。在探討肝壞死自發(fā)性腹膜炎(SBP)發(fā)生機(jī)制時(shí)，研究腸道SIgA變化至關(guān)重要。本研究對(duì)重型肝炎臨床患者腸道SI

2、gA進(jìn)行檢測(cè)，并建立急性肝壞死動(dòng)物模型和體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞，觀察腸道IgA、SIgA和SC變化情況以及TNF-α和NO對(duì)腸上皮細(xì)胞分泌SC的影響，以探討在急性肝壞死時(shí)腸道免疫屏障的變化，從而研究SBP發(fā)生機(jī)制。 材料和方法：1.對(duì)象1.1臨床患者：30例重型肝炎病例為2004-2005年中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科入院患者，20例重型肝炎死亡病例的腸、肝組織由北京佑安醫(yī)院和第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院提供。 1.2動(dòng)物模型：采

3、用雄性Balb/C小鼠390只，隨機(jī)分為八個(gè)組，即：1組：生理鹽水組，2組：LPS，3組：D-GalN，4組：LPS+D-GalN，5組：D-GalN+TNF-α，6組：D-GalN+LPS+TNF-α抗體，7組：TNF-α，8組：D-GalN+LPS+TNF-R1抗體，除6、8組外每組分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2h、6h、9h、12h和24h)，第6、8組以9h為時(shí)間點(diǎn)。分別取肝和腸等標(biāo)本待檢。 2.方法2.1分別用免疫散射比濁法和放射免

4、疫方法檢測(cè)重型肝炎患者血清和糞便中IgA、SIgA的含量。 2.2免疫組化方法檢測(cè)重型肝炎患者腸、肝組織內(nèi)IgA、SC(SIgA)的表達(dá)。 2.3雙免疫熒光染色檢測(cè)重型肝炎患者腸上皮細(xì)胞漿、膜上SIgA的表達(dá)。 2.4建立ELISA方法檢測(cè)急性肝壞死動(dòng)物模型血清、糞便IgA的含量。 2.5用放射免疫方法檢測(cè)急性肝壞死動(dòng)物模型糞便SIgA的含量。 2.6免疫組化方法檢測(cè)急性肝壞死動(dòng)物模型腸道IgA的

5、分布和表達(dá)。 2.7實(shí)時(shí)定量PCR(real-timequantitativePCR)檢測(cè)小鼠腸組織SCmRNA的相對(duì)含量 2.8利用免疫組化、Weasternblot、Real-timePCR方法檢測(cè)TNF-α和NO對(duì)Caco-2細(xì)胞分泌SC的影響。 結(jié)果1.重型肝炎患者血清和糞便中IgA和SIgA較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)。 2.免疫組化檢測(cè)重型肝炎患者腸道SC和IgA：重型肝炎腸組織SC染

6、色較正常腸組織明顯減弱，甚至難見，IgA染色也明顯減弱。腸道SC、IgA免疫組化光密度分析顯示重肝患者腸組織SC、IgA較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。 3.腸道雙免疫熒光染色顯示正常腸組織腸上皮細(xì)胞漿(分泌的SC)呈橘紅色，膜上SIgA呈黃色，固有層活化淋巴細(xì)胞呈橘紅色或黃色；重型肝炎腸組織腸上皮細(xì)胞漿、膜染色均明顯減弱。 4.LPS/GalN引起的肝壞死小鼠糞便SIgA含量升高與NS組相比均有顯著差異(P＜0.

7、01)，在9h達(dá)到高峰。糞便、血清IgA6h開始升高，維持到24h，與NS組比較有顯著意義(P＜0.01)。 5.LPS引起的肝壞死小鼠腸道IgA免疫組化染色：IgA染色急性肝壞死腸組織較正常腸組織陽性明顯減弱。IgA的光密度注射LPS+GalN后在2h開始下降，維持到12h，與NS組相比有顯著意義(P＜0.01)。 6.LPS/GalN引起的肝壞死小鼠腸組織SCmRNA的表達(dá)：LPS引起的肝壞死小鼠在2hSCmRNA的

8、表達(dá)量開始下降，9h達(dá)到最低，與NS組均有顯著差異(P＜0.01)。 7.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動(dòng)物變化和死亡率與LPS/GalN類似，肝組織和腸組織病變與LPS/GalN相同，隨時(shí)間逐漸加重，說明TNF-α是急性肝壞死的重要介質(zhì)。 8.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動(dòng)物腸道免疫組化結(jié)果：IgA染色可見NS組、抗TNF-IgG組、抗TNF-R1組腸組織腸上皮細(xì)胞漿、膜和固有層活化淋巴細(xì)胞呈棕黃色強(qiáng)

9、陽性，由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死腸組織腸上皮細(xì)胞漿陽性明顯減弱。IgA的光密度注射TNF-α+GalN后在2h開始下降，6h達(dá)最低維持到12h，與NS組相比有顯著意義(P＜0.01)，這更證明TNF-α是急性肝壞死的重要介質(zhì)。 9.由TNF-α/GalN誘導(dǎo)的肝壞死小鼠腸組織SCmRNA的表達(dá)：TNF-α肝壞死組中，2h、6h、9hSCmRNA的表達(dá)量均下降，9h達(dá)到最低，與NS組亦有顯著差異(P＜0.01)，抗體組

10、(抗TNF-α-IgG組、抗TNF-R1組)SCmRNA表達(dá)無明顯變化。進(jìn)一步證明TNF-α在肝壞死中起重要作用。 10.免疫組化染色分析Caco-2細(xì)胞表達(dá)SC：無TNF-α刺激時(shí)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞SC陽性細(xì)胞大約為0.5-0.6％，用不同濃度TNF-α刺激后SC陽性細(xì)胞明顯增加，400ng/mlTNF-α刺激后SC陽性細(xì)胞達(dá)到3.0-3.5％。SC主要位于Caco-2細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上。用不同濃度的Sin1刺激后SC陽性細(xì)胞

11、明顯下降，不同濃度的Sin1刺激后SC陽性細(xì)胞率分別為0μM0.5-0.6％、125μM0.46-0.50％、250μM0.26-0.30％、500μM0.12-0.15％、1000μM0.18-0.22％。 11.Caco-2細(xì)胞分泌SC蛋白的半定量分析：SC的分子量為80KD，結(jié)果表明在80KD位置有明顯條帶，加入TNF-α后蛋白表達(dá)量明顯增加，與無TNF-α(即濃度為0ng/ml)刺激Caco-2分泌SC蛋白表達(dá)量相比明顯

12、升高(P＜0.01)；加入Sin1后蛋白表達(dá)量明顯下降，與無Sin1(即濃度為0μM)刺激Caco-2分泌SC蛋白表達(dá)量相比明顯降低(P＜0.01)。 12.TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞分泌SC的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響：檢測(cè)的mRNA通過管家基因GAPDH進(jìn)行校正，隨TNF-α濃度升高SC的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P＜0.01)。加入Sin1后SC的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，與無Sin1(即濃度為0μM)刺激Caco-2

13、分泌SC表達(dá)的mRNA相對(duì)含量相比明顯下降(P＜0.01)。 結(jié)論1.重型肝炎患者血清和糞便中IgA和SIgA較正常對(duì)照組明顯升高，但重肝患者腸道SC、IgA在腸上皮細(xì)胞漿內(nèi)和膜上分布明顯減弱。 2.重型肝炎患者腸上皮細(xì)胞漿和膜上SC、IgA表達(dá)降低，引起腸上皮細(xì)胞表面的SIgA減少，導(dǎo)致腸道免疫屏障損傷，引起腸道免疫防御功能減弱，可能是重型肝炎患者腹膜炎的一個(gè)原因。 3.急性肝壞死小鼠血清、糞便IgA、SIgA

14、顯著升高，但急性肝壞死小鼠IgA在腸上皮細(xì)胞漿內(nèi)、膜上和固有層活化淋巴細(xì)胞分布明顯減弱，與重型肝炎患者變化一致，因此急性肝壞死動(dòng)物模型是研究重型肝炎腸道免疫防御的一個(gè)很好模型。 4.急性肝壞死小鼠腸上皮細(xì)胞表達(dá)的SC在分子水平明顯減少，是腸上皮細(xì)胞膜上SIgA分布明顯減少的原因，最終引起急性肝壞死小鼠腸道免疫屏障功能明顯減弱。 5.由TNF-α/GalN引起的急性肝壞死動(dòng)物死亡率和腸道SC、SIgA變化與LPS/GalN