自噬在不同急性肝損傷模型中的變化及調(diào)節(jié)機制的對比研究.pdf

1、自噬是大部分真核細胞中普遍存在的一種依賴溶酶體的細胞代謝途徑，通過降解細胞內(nèi)泛素化蛋白或受損細胞器，以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質代謝及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在細胞生長、分化、衰老、凋亡中發(fā)揮重要作用。肝臟是體內(nèi)物質代謝的重要器官，自噬能維持肝內(nèi)細胞代謝及肝組織正常功能，大量研究證明，多種原因如酒精、藥物、病毒性肝炎、缺血再灌注等損傷導致的肝臟疾病中，均存在自噬水平的變化，并且其對肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有重要影響。藥物是導致急性肝損傷的重要原因之一，許多藥物

2、均能引起急性肝損傷，但其機制卻又不盡相同，對乙酰氨基酚和四氯化碳是常用的致急性肝損傷的藥物和毒物，將兩種模型對比研究，探索不同肝損傷模型中自噬水平的變化情況及在疾病進展中的作用，比較兩者自噬調(diào)節(jié)機制的異同。
　　目的:
　　本研究通過用對乙酰氨基酚和四氯化碳分別建立急性肝損傷模型，觀察不同肝損傷模型中自噬水平的變化，并比較兩種模型中調(diào)節(jié)自噬的相關因子的變化的異同，進一步探索自噬在肝損傷中的調(diào)節(jié)機制及變化情況;通過觀察藥物誘導

3、及抑制自噬后肝損傷程度的變化，明確自噬在兩種不同的急性肝損傷中的作用。從而進一步完善對急性肝損傷的認識，為今后臨床工作的治療提供新的思路及理論基礎。
　　方法:
　　將56只清潔級健康雄性C57小鼠隨機分成對照組、模型組和干預組。對照組（A組，n=8），分正常對照組(A-b組，n=4)和植物油對照組（A-c組，n=4），正常對照組腹腔注射同體積的生理鹽水，植物油對照組腹腔注射同體積的植物油，于注射后6h處死小鼠取標本。模型組

4、分APAP模型組和CCl4模型組，其中APAP模型組（B組）又分為APAP2h組（B1組，n=4）、APAP6h組（B2組，n=4）、APAP12h組（B3組，n=4）、APAP24h組（B4組，n=4），分別于腹腔注射APAP后2h、6h、12h、24h處死小鼠取標本;CCl4模型組（C組）也分為CCl42h組(C1組，n=4)、CCl46h組(C2組，n=4)、CCl412h組(C3組，n=4)、CCl424h組(C4組，n=4)，

5、分別于腹腔注射植物油稀釋的CCl4后2h、6h、12h、24h處死小鼠取標本。處理組（D組）分雷帕霉素處理組(D1組)，腹腔注射APAP(D1-b組，n=4)或CCl4(D1-c組，n=4)后隨即注射雷帕霉素，于6h后處死小鼠取標本;氯喹處理組(D2組)，腹腔注射APAP(D2-b組，n=4)或CCl4(D2-c組，n=4)后隨即注射氯喹，于6h后處死小鼠取標本。檢測各組小鼠血清ALT水平，HE染色觀察肝損傷程度;免疫組化檢測各組小鼠肝

6、臟內(nèi)LC3Ⅱ，p62的表達情況;Western blot檢測各組小鼠肝臟內(nèi)LC3Ⅱ，p62蛋白的表達，檢測對照組和模型組小鼠mTOR和beclin1的蛋白表達情況。
　　結果:
　　1.模型組（B組、C組）及處理組（D組）血清ALT水平及肝細胞損傷程度均較對照組（A組）升高，且隨時間延長，血清ALT水平及肝細胞損傷程度增加。與6h模型組（B2組、C2組）相比，血清ALT水平和肝細胞損傷程度在雷帕霉素組（D1組）明顯減輕，而在

7、氯喹組（D2組）中明顯增加。
　　2.免疫組化結果和western blot結果均顯示，模型組（B組、C組）可見LC3Ⅱ陽性表達，且隨時間延長表達增多;處理組（D組）比6h模型組（B2組、C2組）表達增多。P62在對照組陽性表達率最高，模型組陽性表達少，且隨時間延長而減少;雷帕霉素組（D1組）比6h模型組（B2組、C2組）表達減少，氯喹組（D2組）比6h模型組（B2組、C2組）表達增多。
　　3.western blot結果

8、顯示，mTOR在模型組（B組、C組）中表達較對照組（A組）減少，且隨時間延長而減少;beclin1在APAP模型組（B組）中表達較對照組（A組）增多，且有時間依賴性，而beclin1在CCl4模型組（C組）中的表達與對照組無明顯差異。
　　結論:
　　1.在APAP和CCl4所致的急性肝損傷模型中，均存在自噬水平的升高，2h即可出現(xiàn)自噬水平變化，并隨時間延長而增加。
　　2.在促進自噬后，肝損傷程度減輕;抑制自噬后，肝