自噬在不同急性肝損傷模型中的變化及調(diào)節(jié)機(jī)制的對(duì)比研究.pdf

1、自噬是大部分真核細(xì)胞中普遍存在的一種依賴溶酶體的細(xì)胞代謝途徑，通過降解細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白或受損細(xì)胞器，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老、凋亡中發(fā)揮重要作用。肝臟是體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要器官，自噬能維持肝內(nèi)細(xì)胞代謝及肝組織正常功能，大量研究證明，多種原因如酒精、藥物、病毒性肝炎、缺血再灌注等損傷導(dǎo)致的肝臟疾病中，均存在自噬水平的變化，并且其對(duì)肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有重要影響。藥物是導(dǎo)致急性肝損傷的重要原因之一，許多藥物

2、均能引起急性肝損傷，但其機(jī)制卻又不盡相同，對(duì)乙酰氨基酚和四氯化碳是常用的致急性肝損傷的藥物和毒物，將兩種模型對(duì)比研究，探索不同肝損傷模型中自噬水平的變化情況及在疾病進(jìn)展中的作用，比較兩者自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的異同。
　　目的:
　　本研究通過用對(duì)乙酰氨基酚和四氯化碳分別建立急性肝損傷模型，觀察不同肝損傷模型中自噬水平的變化，并比較兩種模型中調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)因子的變化的異同，進(jìn)一步探索自噬在肝損傷中的調(diào)節(jié)機(jī)制及變化情況;通過觀察藥物誘導(dǎo)

3、及抑制自噬后肝損傷程度的變化，明確自噬在兩種不同的急性肝損傷中的作用。從而進(jìn)一步完善對(duì)急性肝損傷的認(rèn)識(shí)，為今后臨床工作的治療提供新的思路及理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　將56只清潔級(jí)健康雄性C57小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。對(duì)照組（A組，n=8），分正常對(duì)照組(A-b組，n=4)和植物油對(duì)照組（A-c組，n=4），正常對(duì)照組腹腔注射同體積的生理鹽水，植物油對(duì)照組腹腔注射同體積的植物油，于注射后6h處死小鼠取標(biāo)本。模型組

4、分APAP模型組和CCl4模型組，其中APAP模型組（B組）又分為APAP2h組（B1組，n=4）、APAP6h組（B2組，n=4）、APAP12h組（B3組，n=4）、APAP24h組（B4組，n=4），分別于腹腔注射APAP后2h、6h、12h、24h處死小鼠取標(biāo)本;CCl4模型組（C組）也分為CCl42h組(C1組，n=4)、CCl46h組(C2組，n=4)、CCl412h組(C3組，n=4)、CCl424h組(C4組，n=4)，

5、分別于腹腔注射植物油稀釋的CCl4后2h、6h、12h、24h處死小鼠取標(biāo)本。處理組（D組）分雷帕霉素處理組(D1組)，腹腔注射APAP(D1-b組，n=4)或CCl4(D1-c組，n=4)后隨即注射雷帕霉素，于6h后處死小鼠取標(biāo)本;氯喹處理組(D2組)，腹腔注射APAP(D2-b組，n=4)或CCl4(D2-c組，n=4)后隨即注射氯喹，于6h后處死小鼠取標(biāo)本。檢測(cè)各組小鼠血清ALT水平，HE染色觀察肝損傷程度;免疫組化檢測(cè)各組小鼠肝

6、臟內(nèi)LC3Ⅱ，p62的表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)各組小鼠肝臟內(nèi)LC3Ⅱ，p62蛋白的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)照組和模型組小鼠mTOR和beclin1的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.模型組（B組、C組）及處理組（D組）血清ALT水平及肝細(xì)胞損傷程度均較對(duì)照組（A組）升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，血清ALT水平及肝細(xì)胞損傷程度增加。與6h模型組（B2組、C2組）相比，血清ALT水平和肝細(xì)胞損傷程度在雷帕霉素組（D1組）明顯減輕，而在

7、氯喹組（D2組）中明顯增加。
　　2.免疫組化結(jié)果和western blot結(jié)果均顯示，模型組（B組、C組）可見LC3Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增多;處理組（D組）比6h模型組（B2組、C2組）表達(dá)增多。P62在對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率最高，模型組陽(yáng)性表達(dá)少，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少;雷帕霉素組（D1組）比6h模型組（B2組、C2組）表達(dá)減少，氯喹組（D2組）比6h模型組（B2組、C2組）表達(dá)增多。
　　3.western blot結(jié)果

8、顯示，mTOR在模型組（B組、C組）中表達(dá)較對(duì)照組（A組）減少，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少;beclin1在APAP模型組（B組）中表達(dá)較對(duì)照組（A組）增多，且有時(shí)間依賴性，而beclin1在CCl4模型組（C組）中的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.在APAP和CCl4所致的急性肝損傷模型中，均存在自噬水平的升高，2h即可出現(xiàn)自噬水平變化，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　　2.在促進(jìn)自噬后，肝損傷程度減輕;抑制自噬后，肝