融合表達Ag85B-ESAT6的結(jié)核病疫苗的構(gòu)建及其免疫學特性研究.pdf

1、MTB早期培養(yǎng)濾液蛋白(CFP)中的Ag85B和ESAT6是重要的保護性抗原,廣泛用于新型TB疫苗研究.該研究先后構(gòu)建了融合表達Ag85B和ESAT6基因的亞單位疫苗、基因疫苗以及重組BCG疫苗,并比較了各自誘發(fā)的細胞免疫應(yīng)答水平和對感染小鼠的保護力,以期為TB的防治提供新型疫苗.設(shè)計了含不同酶切位點的ag85b和esat6引物,采用PCR的方法從MTB毒株H37Rv-DNA中分別擴增出相應(yīng)大小的DNA片段,將目的片段與pGEM-T-e

2、asy載體連接后測序,PCR獲得的ag85b和esat6序列與GenBank報道的完全一致.將測序正確的ag85b和esat6按照不同的酶切位點聯(lián)合克隆入pProEX HT表達載體,成功誘導表達融合蛋白,同時與6×his的單克隆抗體(mAb)進行Western-blot分析,為了檢測融合蛋白免疫小鼠引起的細胞免疫應(yīng)答,最后一次免疫完成四周后,分離免疫小鼠的脾淋巴細胞,體外用CFP刺激,結(jié)果融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag

3、85B誘導產(chǎn)生的IFN-γ分別為3.51±0.30ng/ml和4.05±0.41ng/ml,顯著高于生理鹽水對照組(0.5±0.25ng/ml,P<0.05),但不及BCG免疫組(5.55±0.31ng/ml).將ag85b和esat6按照不同的酶切位點克隆入真核表達載體pcDNA3,分別命名為A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDNA3-A<,F>.將重組質(zhì)粒A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDN

4、A3-A<,F>電轉(zhuǎn)CHO細胞,RT-PCR檢測融合蛋白mRNA的表達,用間接免疫熒光可以在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細胞內(nèi)檢測到較強的綠色熒光,證實CHO細胞內(nèi)融合蛋白的表達.采用PCR方法從MTB毒株H37Rv-DNA擴增出熱休克蛋白Hsp60基因及其信號肽序列α-ss,將測序正確的hsp60和α-ss分別克隆入E.coli-BCG穿梭載體pOLYG中,構(gòu)建分枝桿菌分泌表達載體pDE22,按相應(yīng)的酶切位點將ag85b和esat6按照不同的