結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗鼻粘膜免疫效應(yīng)研究.pdf

1、結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染病，目前仍是危害全球公共衛(wèi)生與健康的主要疾病之一。據(jù)WHO公布的《2009年結(jié)核病控制報告》顯示，2007年TB的新增病例約達(dá)927萬，流行病例達(dá)到1370萬，約有132萬死亡病例（僅指非感染HIV的TB病例）和46萬HIV（human immunodeficiency virus）-陽性的TB死亡病例。

2、近年來，隨著人口流動的增加、多重耐藥菌株（mult-drug resistance，MDR-TB）的出現(xiàn)、Mtb與HIV病毒伴發(fā)感染的發(fā)生以及卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）接種防護的自身局限性，結(jié)核病的發(fā)生率在全球呈上升趨勢。
　　 當(dāng)前唯一可用的疫苗是BCG，其免疫保護效果存在顯著差異（保護率0％～80％）。BCG在降低兒童原發(fā)性結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、粟粒性肺結(jié)核的發(fā)生方面發(fā)揮了重要作用，但對

3、成人結(jié)核病預(yù)防作用則較小，且艾滋?。ˋcquired ImmuneDeficiency Syndrome，AIDS）病人接種BCG后可引起全身播散性感染。鑒于BCG的不足，研制新型疫苗以及對已研制的疫苗制定新的免疫策略增強抗結(jié)核效應(yīng)就迫在眉睫。
　　 我們實驗室在前期的研究中，構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合基因與IL-21共表達(dá)的DNA疫苗，通過肌肉注射的途徑免疫實驗動物，顯示了一定的免疫效應(yīng)。由于Mtb的主要傳播途

4、徑為呼吸道，鼻粘膜免疫在有效控制結(jié)核感染方面顯得尤為重要。鼻腔生理環(huán)境溫和，抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的閾值較低，加上鼻腔內(nèi)含有豐富的血管，而且鼻腔免疫操作方便、創(chuàng)傷小等有利條件，因此，在前期實驗基礎(chǔ)上，我們采用鼻粘膜免疫的途徑來觀察其對實驗動物的免疫及保護效果。本實驗分為三部分：
　　 一、鑒定結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗靶抗原的表達(dá)
　　 目的：鑒定結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫

5、苗靶抗原在小鼠黑色素瘤（B16F10）細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6與IL-21共表達(dá)DNA疫苗轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，通過G418壓力篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞克隆。將該克隆擴增，采用RT-PCR的方法鑒定靶抗原IL-21的表達(dá)；采用Western blot方法鑒定其中靶抗原Ag85A、ESAT-6的表達(dá)。
　　 結(jié)果：通過轉(zhuǎn)染及RT-PCR、Western blot鑒定

6、，結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗能穩(wěn)定表達(dá)目的基因IL-21、Ag85A、ESAT-6。
　　 結(jié)論：成功鑒定了結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗靶抗原表達(dá)，為下一步研究其對實驗動物的免疫效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6與IL-21DNA疫苗鼻粘膜免疫效應(yīng)研究
　　 目的：探討結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗，鼻粘膜免疫

7、誘導(dǎo)C57BI/6小鼠免疫應(yīng)答效應(yīng)，尋求合適免疫途徑誘發(fā)小鼠產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答。
　　 方法：實驗分為生理鹽水對照組、空質(zhì)粒組、Ag85A-ESAT-6組和Ag85A-ESAT-6-IL-21組，采用鼻粘膜免疫C57BL/6小鼠的方法，100μg不同疫苗/只，每次間隔一周，共免疫三次。通過NK細(xì)胞和脾細(xì)胞殺傷活性、脾淋巴細(xì)胞增殖實驗，以及小鼠血清抗體、IFN-γ和IL-4水平的檢測，評價鼻粘膜免疫誘導(dǎo)C57BI/6小鼠免疫應(yīng)答效

8、果。
　　 結(jié)果：結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗組，與對照組相比，在NK細(xì)胞殺傷活性、脾細(xì)胞殺傷活性、脾淋巴細(xì)胞增殖方面顯示出較好的免疫效應(yīng)。同時，免疫鼠的血清中抗體水平、IFN-γ和IL-4水平也有明顯上升，差異有顯著性意義。
　　 結(jié)論：結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6與Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗能夠誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步在動物體內(nèi)進(jìn)行保護性實驗

9、提供了依據(jù)。
　　 三、結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6與IL-21共表達(dá)DNA疫苗初免-BCG鼻粘膜加強免疫及其保護效應(yīng)研究
　　 目的：采用結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6與Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗初免-BCG加強（Prime-Boost）策略，研究鼻粘膜免疫對C57BL/6小鼠的免疫效果及對結(jié)核桿菌的保護效應(yīng)，為結(jié)核DNA疫苗采用新的免疫方法提供新的思路。
　　 方法：實驗分為BCG皮

10、下對照組、空質(zhì)粒組、Ag85A-ESAT-6組、Ag85A-ESAT-6-IL-21組和BCG粘膜免疫組。采用鼻粘膜免疫C57BL/6小鼠的方法，100μg不同疫苗/只，每次間隔一周，不同DNA疫苗初免兩次，再用BCG加強免疫一次，共免疫三次； BCG皮下組和BCG粘膜組三次均采用BCG進(jìn)行免疫。末次免疫兩周后，每只鼠用200μl1×106CFU結(jié)核桿菌H37Rv菌液通過尾靜脈注射，進(jìn)行攻擊實驗，評價不同疫苗對結(jié)核桿菌的保護效果。

11、>　　 結(jié)果：與單獨BCG皮下組相比，DNA疫苗初免-BCG加強組的NK細(xì)胞殺傷活性、脾細(xì)胞殺傷活性、脾淋巴細(xì)胞增殖有一定增強；脾細(xì)胞上清與攻擊前后血清中IFN-γ的分泌水平明顯上升；同時支氣管肺泡灌洗液（BAL）中的分泌性IgA（sIgA）的量在攻擊前后顯示一定的變化：BCG皮下組>Ag85A-ESAT-6-IL-21組>BCG粘膜組。攻擊后，Ag85A-ESAT-6-IL-21組與BCG粘膜組肺組織載菌量與BCG皮下組相比，有所減