PEI修飾的納米佐劑增強結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗效應(yīng)的研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分歧桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性感染性疾病，目前仍然是威脅人類健康的主要感染性疾病之一，亦是世界上感染性疾病致死的主要病因。近年來，隨著人口流動的增加、多重耐藥菌株(mult-drug resistance，MDR-TB)的出現(xiàn)、MTB與人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus HIV)伴發(fā)感染的發(fā)生，以及傳統(tǒng)的結(jié)核病疫苗-卡介苗(Baci

2、llus Calmette Guerin，BCG)接種防護的自身局限性，即僅對兒童有一定保護作用，但不能有效預(yù)防成人結(jié)核桿菌的感染，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生率在全球呈上升趨勢。
　　眾所周知，BCG在降低兒童原發(fā)性結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、粟粒性肺結(jié)核的發(fā)生方面發(fā)揮了重要作用，但對成人結(jié)核病預(yù)防作用，其免疫保護效果存在顯著差異（保護率0％～80％），并且艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)患

3、者接種BCG后可引起全身播散性感染，且發(fā)病后治療困難，病死率高，鑒于BCG的這些不足，研制新型疫苗控制結(jié)核病更為緊迫。
　　本實驗室在前期的研究中，構(gòu)建了結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6(6-kDa early secretoryantigen target)融合基因與IL-21共表達(dá)的DNA疫苗，通過肌肉注射的途徑免疫實驗動物，顯示了一定的免疫效應(yīng)，但對實驗動物預(yù)防結(jié)核桿菌感染的效果仍未達(dá)到或超過傳統(tǒng)結(jié)核病疫苗-BCG。針對這一

4、狀況和當(dāng)前結(jié)核疫苗研究存在的問題，本課題旨在原有的基礎(chǔ)上，設(shè)計新型DNA疫苗，即選用聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)表面修飾的Fe3O4納米材料作為佐劑，以增強Ag85A-ESAT-6與IL-21共同表達(dá)的DNA疫苗的免疫原性，增強免疫鼠在結(jié)核桿菌攻擊后的預(yù)防及正常鼠受結(jié)核菌感染后的治療效果，以期篩選出優(yōu)于BCG的結(jié)核預(yù)防和治療性納米佐劑增強型的DNA疫苗，并用于臨床前研究，為最終研制高效價廉安全的結(jié)核疫苗奠定試驗

5、基礎(chǔ)。
　　目的：
　　探討聚乙烯亞胺(PEI)修飾的Fe3O4納米顆粒負(fù)載的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗的免疫效應(yīng)及對免疫鼠防治結(jié)核桿菌的保護性效果。
　　方法：
　　1.首先采用PEI修飾的Fe3O4納米顆粒作為佐劑，制備新型的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)并對其表征，隨后檢測該疫苗能否有效轉(zhuǎn)染進細(xì)胞表達(dá)靶抗原Ag85A-ES

6、AT-6和IL-21蛋白。
　　2.將PEI修飾的Fe3O4納米顆粒負(fù)載的新型pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21 DNA疫苗(Np-PAEI)，與單表達(dá)結(jié)核桿菌融合靶抗原(Ag85A-ESAT-6)的pIRES-Ag85A-ESAT-6DNA疫苗(PAE)和共同表達(dá)Ag85A-ESAT-6與IL-21的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21DNA疫苗(PAEI)分別接種C57BL/6小鼠三次，再用結(jié)核桿菌攻

7、擊小鼠，觀察新型DNA疫苗對小鼠的保護性效應(yīng)。
　　3.通過不同的免疫學(xué)和病理學(xué)方法，分析新型Np-PAEI DNA疫苗及其不同對照組疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對結(jié)核桿菌的細(xì)胞免疫和體液免疫及免疫病理反應(yīng)。
　　4.采用PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗與BCG聯(lián)合采用初免-促免（序-貫）策略免疫小鼠，并觀察免疫小鼠對抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護性作用。
　　5.采用標(biāo)準(zhǔn)有毒株H37Rv結(jié)核桿菌以氣溶膠霧化吸入方式攻擊小鼠，成

8、功復(fù)制結(jié)核病感染模型，再用PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗接種治療，并與BCG免疫治療相比較，觀察新型DNA疫苗對小鼠結(jié)核桿菌感染的治療效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1.PEI修飾的PAEI質(zhì)粒疫苗可以被有效吸附到Fe3O4納米顆粒表面，并在透射電鏡下顯示良好的形態(tài)。Zeta電位分析顯示，在pH在7.2-7.4范圍內(nèi)，吸附了PAEI質(zhì)粒疫苗的Np-PAEI的Zeta電位為36mV左右，與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相符合。PEI修飾的Np-P

9、AEI納米顆粒疫苗不僅能被有效的轉(zhuǎn)染進B16F10細(xì)胞內(nèi)，而且該疫苗不會明顯影響所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的繁殖和生長。RT-PCR和Western blotting結(jié)果提示，新型Np-PAEI DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)可以正確的表達(dá)Ag85A-ESAT-6靶抗原以及IL-21蛋白。
　　2.相比較于單獨的PAE DNA疫苗和PAEI DNA疫苗，PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗顯著增強了小鼠針對結(jié)核分枝桿菌的保護效應(yīng)，并且顯著抑制了小鼠體內(nèi)的結(jié)

10、核分枝桿菌的生長，與不同對照疫苗組相比，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　3.在接種了不同DNA疫苗的小鼠體內(nèi)都產(chǎn)生了針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，特別是PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗免疫鼠，顯著增強的NK細(xì)胞、脾臟細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的殺傷效率;IFN-γ的分泌量和對Ag85A和ESAT-6的抗體量也明顯增加，與不同對照疫苗組相比，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　4.免疫病理結(jié)果顯示，PEI修飾的Np-

11、PAEI DNA疫苗免疫鼠，肺部結(jié)核結(jié)節(jié)和免疫病理損傷及脾臟轉(zhuǎn)移的結(jié)核病灶與不同對照疫苗組相比，均明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
　　5.與BCG免疫治療相比較，PEI修飾的Np-PAEI DNA疫苗能產(chǎn)生增強的小鼠抗結(jié)核桿菌感染的治療效應(yīng)，體現(xiàn)在肺部荷菌量減少及病理損傷減輕，小鼠體重增長相對加快。
　　結(jié)論：
　　研制的PEI修飾的Fe3O4納米顆粒負(fù)載的pIRES-Ag85A-ESAT-6-IL-21