解脲脲原體誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、近年來(lái)，解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum,UU）在產(chǎn)科領(lǐng)域的感染引起醫(yī)學(xué)界的不斷關(guān)注。據(jù)報(bào)道，在自然流產(chǎn)、胎膜早破及早產(chǎn)等產(chǎn)婦胎盤(pán)中檢出 UU的陽(yáng)性率顯著高于正常產(chǎn)婦，亦有人從自然流產(chǎn)者的死胎和畸胎中培養(yǎng)出 UU，提示妊娠期間生殖道UU感染可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播，導(dǎo)致妊娠過(guò)程惡化，從而引發(fā)不良妊娠結(jié)局。臍靜脈是妊娠期間胎兒從母體獲取營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的通道，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothe

2、lial cells, HUVEC）襯覆于血管內(nèi)壁，是構(gòu)成血管通透性的主要屏障，在免疫防御方面發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí)，半胱天冬酶（caspase）是引發(fā)細(xì)胞凋亡的基本結(jié)構(gòu)及凋亡的執(zhí)行器，可以通過(guò)線(xiàn)粒體/細(xì)胞色素 c通路和死亡受體通路兩種不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)將UU與 HUVEC在體外共培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞凋亡相關(guān)因素的檢測(cè)，來(lái)探討UU誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制，從而為闡明妊娠期間UU垂直傳播的可能機(jī)制提供

3、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　用血清4型UU標(biāo)準(zhǔn)菌液作用于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，建立感染模型；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；比色法檢測(cè) caspase3、caspase8和caspase9產(chǎn)生量；酶標(biāo)儀檢測(cè) TNFα產(chǎn)生量；分別加入 TNFα抗體、caspase3、caspase8和caspase9抑制劑與HUVEC孵育后加UU，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率有無(wú)改變。
　　用100μl濃度為106CCU/ml的血清4型UU標(biāo)準(zhǔn)菌液刺

4、激處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組（UU液體培養(yǎng)基刺激），分別在體外培養(yǎng)2，4，8，12小時(shí)后終止刺激，取細(xì)胞做ANNEXIN V FITC/PI染色，流式儀檢測(cè)凋亡率，顯示實(shí)驗(yàn)組 HUVEC凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組凋亡率均隨之升高(P<0.01)，說(shuō)明UU可以在體外誘導(dǎo)HUVEC凋亡。
　　采用同樣方法感染HUVEC，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組，于作用8小時(shí)后終止培養(yǎng)，

5、取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，比色法檢測(cè)caspase3、caspase8和caspase9產(chǎn)生量，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，UU作用組 caspase3、caspase8和caspase9的產(chǎn)生量均明顯升高（P<0.01）。酶標(biāo)儀檢測(cè)TNFα產(chǎn)生量，結(jié)果顯示：UU作用組TNFα的濃度較對(duì)照組明顯升高（P<0.01）。
　　加入TNFα抗體、caspase3、caspase8和caspase9抑制劑8小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HUVEC凋亡率,結(jié)果