鹽負(fù)荷誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的時(shí)相特征及機(jī)制.pdf

1、目的:探討高鹽誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的時(shí)相特征及機(jī)制,以闡明鹽在高血壓等血管內(nèi)皮功能障礙性疾病中的意義。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,選第3—9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與加載鹽負(fù)荷的RPMI1640培養(yǎng)基(氯化鈉終濃度提高30mmol/L)共同孵育不同時(shí)間(6h、12h、24h、48h)作為測(cè)定組;將與測(cè)定組等體積的D-Hank’S液代替NaCl加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)細(xì)胞48h,作為空白對(duì)照組;應(yīng)用等毫摩爾甘

2、露醇代替氯化鈉培養(yǎng)細(xì)胞48h,并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)以排除實(shí)驗(yàn)干擾因素。細(xì)胞爬片并進(jìn)行HE染色,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;CCK-8試劑比色法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性;酶標(biāo)儀檢測(cè)乳酸脫氫酶漏出量;采用一氧化氮試劑盒(硝酸還原酶法)比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量;生化法檢測(cè)NOS活性;細(xì)胞爬片,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察 eNOS和iNOS在蛋白水平的表達(dá);采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)觀察eNOS和iNOS在基因水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(

3、`x±s)表示,使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:鹽負(fù)荷能導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變和凋亡,細(xì)胞的生長(zhǎng)活性受到抑制,細(xì)胞LDH漏出量增加,且呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系;鹽負(fù)荷呈時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量增加,于24h達(dá)高峰;鹽負(fù)荷能抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性,及其在蛋白水平和基因水平的表達(dá),且呈時(shí)間依賴性;鹽負(fù)荷呈時(shí)間依賴性地引發(fā)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性增強(qiáng),及其在蛋白水平和基因水平的表達(dá)增

4、加,于24h時(shí)達(dá)高峰。通過(guò)應(yīng)用等毫摩爾甘露醇代替氯化鈉培養(yǎng)細(xì)胞并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),證明一氧化氮、LDH、eNOS和iNOS的改變不是由于加載鹽負(fù)荷后滲透壓改變而引起的。
　　結(jié)論:1、鹽負(fù)荷能直接誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。2、鹽負(fù)荷誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷的機(jī)制可能是:eNOS的活性及表達(dá)受到抑制,生理性一氧化氮的合成減少,內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷;同時(shí),鹽負(fù)荷誘導(dǎo)iNOS的活性及表達(dá)增強(qiáng),產(chǎn)生大量病理性的一氧化氮,出現(xiàn)一氧化氮代謝