苦蕎植物絡(luò)合素合酶(FtPCS)基因克隆與功能研究.pdf

1、植物絡(luò)合素(Phytochelatins，PCs)是在植物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種可以有效螯合Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金屬離子的多肽類化合物，其具有高度保守的一級(jí)結(jié)構(gòu):(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2～11)。在植物和酵母細(xì)胞內(nèi)，PCs對(duì)游離重金屬離子的富集和解毒過(guò)程具有重要作用，而植物絡(luò)合素合酶(Phytochelatin synthase，PCS)是催化其合成的關(guān)鍵酶。本實(shí)驗(yàn)研究以Pb2+脅迫條件下的苦蕎葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為

2、基礎(chǔ)，通過(guò)RT-PCR克隆了苦蕎植物絡(luò)合素合酶(FtPCS)基因CDs序列和DNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析。隨后，將獲得的苦蕎FtPCS基因CDs序列分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21Star(DE3)、釀酒酵母YK44突變體菌株、以及擬南芥植株進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)其在重金屬Cd2+脅迫條件下的功能和表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步揭示FtPCS在苦蕎植物重金屬富集和解毒過(guò)程中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究得到的主要結(jié)論有:
　　

3、(1)苦蕎植物絡(luò)合素合酶（FtPCS）基因的CDs序列長(zhǎng)1485bp，編碼494個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為55.10kDa;FtPCS基因的DNA序列長(zhǎng)5456bp，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，且內(nèi)含子兩側(cè)的剪接位點(diǎn)均滿足GT-AG規(guī)則。生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)tPCS基因氨基酸序列N-端序列高度保守，包括5個(gè)保守的Cys-殘基特征位點(diǎn)，是FtPCS蛋白活性中心;C-端序列包含12個(gè)可變的Cys-殘基位點(diǎn)，是主要的重金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。

4、>　　(2)通過(guò)NEBuilder HiFi DNA Assembly技術(shù)，構(gòu)建pET28a-PCS重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21Star(DE3)并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，F(xiàn)tPCS在E.coli內(nèi)以包涵體的形式大量表達(dá)。通過(guò)Co2+螯合層析結(jié)合梯度透析復(fù)性，獲得了純化的FtPCS蛋白;通過(guò)反向-HPLC結(jié)合DTNB[5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]柱后衍生的方法，對(duì)FtPCS重組蛋白在Pb2+存在條

5、件下的催化活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，純化的FtPCS蛋白具有催化活性，能將還原型谷胱甘肽(GSH)絡(luò)合生成PC化合物，而低濃度的Pb2+對(duì)其活性具有激活作用。
　　(3)通過(guò)NEBuilder HiFi DNA Assembly技術(shù)，構(gòu)建pYES2-PCS酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化對(duì)重金屬離子Zn2+/Cd2+/Ni2+/Co2+敏感的釀酒酵母YK44突變體菌株，并通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度Cd2+脅迫條件下，

6、轉(zhuǎn)化pYES2-PCS重組質(zhì)粒的酵母菌株比轉(zhuǎn)化空載的酵母菌株對(duì)重金屬Cd2+的耐受性明顯提高。在Cd2+脅迫條件下的酵母生長(zhǎng)曲線同樣表明，F(xiàn)tPCS基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)，能夠彌補(bǔ)其重金屬抗性基因的缺陷，從而提高其對(duì)Cd2+的抗性。
　　(4)構(gòu)建pCAMBIA3301-PCS植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥植株。通過(guò)Basta篩選和PCR擴(kuò)增鑒定，目前已獲得部分T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。該研究結(jié)果為進(jìn)