IGF-1調控β-catenin信號參與糖尿病角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合的機理.pdf

1、第一部分:IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞(Humantelomerase-immortalizedcornealepithelialcells，THCE)及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖對創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達的影響，探討外源性IGF-1對高糖培養(yǎng)的THCE細胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關分子機制，闡明IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細胞創(chuàng)

2、傷愈合中的作用。
　　方法:
　　1.根據(jù)文獻報道的THCE高糖干預模型，分別用5mM-45mM濃度的葡萄糖處理THCE細胞24h或48h，MTT法檢測THCE細胞存活率，篩選合適的高糖濃度及作用時間。根據(jù)文獻報道的外源性IGF-1干預濃度，分別用10-200ng/ml的IGF-1處理THCE細胞48h，MTT法檢測THCE細胞存活率，篩選合適的IGF-1濃度。
　　2.分別用5mM、25mM濃度的葡萄糖預處理THCE

3、細胞48h，經生長因子饑餓12h后，收集未劃傷及劃傷后不同時間點的兩組細胞及細胞培養(yǎng)上清，利用real-timePCR法檢測IGF-1及IGF-1RmRNA表達，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定IGF-1蛋白水平，westernblot分析IGF-1R蛋白表達，免疫熒光細胞化學法檢測IGF-1、IGF-1R蛋白分布及表達。
　　3.比較正常及糖尿病大鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合情況，研究創(chuàng)傷后角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA及蛋

4、白的表達。
　　4.高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同時間點分別對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細胞，利用MTT法檢測細胞增殖能力;細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力;AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色法+流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　5.高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同

5、時間點分別收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫熒光細胞化學法檢測增殖、遷移及凋亡相關因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1.制作高糖干預模型的合適條件為25rmM濃度的葡萄糖處理THCE細胞48h。外源性添加IGF-1的合適濃度為50ng/ml。
　　2.在正常或高糖培養(yǎng)

6、的兩組THCE細胞中，劃傷可刺激IGF-1及IGF-1RmRNA表達上調;劃傷后12及24h，高糖組IGF-1及IGF-1RmRNA表達顯著低于正常組;劃傷后24及48h，高糖組IGF-1及IGF-1R蛋白表達顯著低于正常組;劃傷后48h，高糖組IGF-1及IGF-1R熒光染色強度低于正常組。
　　3.與正常大鼠相比，糖尿病大鼠角膜上皮刨傷愈合顯著延遲。傷后1，2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA表達顯著

7、低于正常大鼠。傷后2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R熒光染色強度低于正常大鼠。
　　4.高糖抑制THCE細胞存活率，下調增殖相關因子ki-67mRNA及蛋白表達。高糖+IGF-1組的細胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達顯著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　5.高糖抑制THCE細胞遷移能力，下調遷移相關因子MMP-2mRNA及蛋白表達。高糖+IGF-1組的細胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達顯

8、著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　6.高糖誘導THCE細胞凋亡，上調促凋亡因子baxmRNA及蛋白表達，下調凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達。添加IGF-1可改善高糖誘導的細胞凋亡及bax、bcl-2表達變化，但與正常組相比，仍存在顯著差異。
　　結論:
　　在THCE細胞及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖抑制創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達。高糖通過抑制IGF-1表達，引起ki-67、MMP-2、bcl

9、-2表達下調、bax表達上調，從而降低THCE細胞增殖、遷移，誘導THCE細胞凋亡，這可能是導致角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。
　　第二部分:β-catenin信號在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后β-catenin信號的表達，探討激活β-catenin信號對高糖培養(yǎng)的THCE細胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關分子機制，闡明β-catenin信號在高糖培養(yǎng)的角

10、膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合中的作用。
　　方法:
　　1.高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加β-catenin信號激活劑Licl(0.5mM)。對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細胞，進行劃傷刺激，于不同時間點利用real-timePCR法檢測β-catenin、cyclinD1、c-mycmRNA表達，westernblot分析β-catenin、cyclinD1、c-Myc蛋白表達

11、。
　　2.高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同時間點分別對5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細胞，利用MTT法檢測細胞增殖能力;細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力;AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色法+流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　3.高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同時間點分別收集5mM葡萄糖、2

12、5mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫熒光細胞化學法檢測增殖、遷移及凋亡相關因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1.高糖抑制β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表達，外源性添加Licl可上調β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表達，激活β-caten

13、in信號。
　　2.高糖抑制THCE細胞存活率，下調增殖相關因子ki-67mRNA及蛋白表達。高糖+Licl組的細胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達顯著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　3.高糖抑制THCE細胞遷移能力，下調遷移相關因子MMP-2mRNA及蛋白表達。高糖+Licl組的細胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達顯著高于高糖組，但與正常組相比，仍存在差異。
　　4.高糖誘導THCE細胞凋亡，上調促凋

14、亡因子baxmRNA及蛋白表達，下調凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達。添加Licl可改善高糖誘導的細胞凋亡及bax、bcl-2表達變化，但與正常組相比，存在顯著差異。
　　結論:
　　在THCE細胞中，高糖通過抑制β-catenin及下游靶基因cyclinD1、c-Myc的表達，引起ki-67、MMP-2、bcl-2表達下調、bax表達上調，從而降低THCE細胞增殖、遷移，誘導THCE細胞凋亡，這可能是導致角膜上皮細

15、胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。
　　第三部分:IGF-1調控β-eatenin信號參與高糖培養(yǎng)的角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合的研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后，外源性IGF-1對β-catenin信號表達的影響，明確IGF-1是否通過調控β-catenin信號共同參與高糖損害的角膜上皮細胞創(chuàng)傷愈合。
　　方法:
　　高糖預處理THCE細胞且生長因子饑餓后，外源性添加IGF-1。對5mM葡萄糖、25mM

16、葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細胞，進行劃傷刺激，于不同時間點利用real-timePCR法檢測β-catenin、cyclinD1mRNA表達，westernblot分析β-catenin、cyclinD1蛋白表達。
　　結果:
　　高糖抑制β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表達，外源性添加IGF-1可顯著上調高糖抑制的β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表達。
　　結論: