IGF-1調(diào)控β-catenin信號(hào)參與糖尿病角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的機(jī)理.pdf

1、第一部分:IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞(Humantelomerase-immortalizedcornealepithelialcells，THCE)及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖對(duì)創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達(dá)的影響，探討外源性IGF-1對(duì)高糖培養(yǎng)的THCE細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制，闡明IGF-1在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)

2、傷愈合中的作用。
　　方法:
　　1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的THCE高糖干預(yù)模型，分別用5mM-45mM濃度的葡萄糖處理THCE細(xì)胞24h或48h，MTT法檢測(cè)THCE細(xì)胞存活率，篩選合適的高糖濃度及作用時(shí)間。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的外源性IGF-1干預(yù)濃度，分別用10-200ng/ml的IGF-1處理THCE細(xì)胞48h，MTT法檢測(cè)THCE細(xì)胞存活率，篩選合適的IGF-1濃度。
　　2.分別用5mM、25mM濃度的葡萄糖預(yù)處理THCE

3、細(xì)胞48h，經(jīng)生長(zhǎng)因子饑餓12h后，收集未劃傷及劃傷后不同時(shí)間點(diǎn)的兩組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用real-timePCR法檢測(cè)IGF-1及IGF-1RmRNA表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定IGF-1蛋白水平，westernblot分析IGF-1R蛋白表達(dá)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)IGF-1、IGF-1R蛋白分布及表達(dá)。
　　3.比較正常及糖尿病大鼠角膜上皮創(chuàng)傷愈合情況，研究創(chuàng)傷后角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA及蛋

4、白的表達(dá)。
　　4.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色法+流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　5.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同

5、時(shí)間點(diǎn)分別收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)增殖、遷移及凋亡相關(guān)因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.制作高糖干預(yù)模型的合適條件為25rmM濃度的葡萄糖處理THCE細(xì)胞48h。外源性添加IGF-1的合適濃度為50ng/ml。
　　2.在正?；蚋咛桥囵B(yǎng)

6、的兩組THCE細(xì)胞中，劃傷可刺激IGF-1及IGF-1RmRNA表達(dá)上調(diào);劃傷后12及24h，高糖組IGF-1及IGF-1RmRNA表達(dá)顯著低于正常組;劃傷后24及48h，高糖組IGF-1及IGF-1R蛋白表達(dá)顯著低于正常組;劃傷后48h，高糖組IGF-1及IGF-1R熒光染色強(qiáng)度低于正常組。
　　3.與正常大鼠相比，糖尿病大鼠角膜上皮刨傷愈合顯著延遲。傷后1，2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1RmRNA表達(dá)顯著

7、低于正常大鼠。傷后2，3天，糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R熒光染色強(qiáng)度低于正常大鼠。
　　4.高糖抑制THCE細(xì)胞存活率，下調(diào)增殖相關(guān)因子ki-67mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+IGF-1組的細(xì)胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　5.高糖抑制THCE細(xì)胞遷移能力，下調(diào)遷移相關(guān)因子MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+IGF-1組的細(xì)胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)顯

8、著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　6.高糖誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡，上調(diào)促凋亡因子baxmRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)。添加IGF-1可改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及bax、bcl-2表達(dá)變化，但與正常組相比，仍存在顯著差異。
　　結(jié)論:
　　在THCE細(xì)胞及糖尿病大鼠角膜上皮中，高糖抑制創(chuàng)傷刺激的IGF-1及IGF-1R表達(dá)。高糖通過抑制IGF-1表達(dá)，引起ki-67、MMP-2、bcl

9、-2表達(dá)下調(diào)、bax表達(dá)上調(diào)，從而降低THCE細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。
　　第二部分:β-catenin信號(hào)在高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后β-catenin信號(hào)的表達(dá)，探討激活β-catenin信號(hào)對(duì)高糖培養(yǎng)的THCE細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制，闡明β-catenin信號(hào)在高糖培養(yǎng)的角

10、膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用。
　　方法:
　　1.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加β-catenin信號(hào)激活劑Licl(0.5mM)。對(duì)5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞，進(jìn)行劃傷刺激，于不同時(shí)間點(diǎn)利用real-timePCR法檢測(cè)β-catenin、cyclinD1、c-mycmRNA表達(dá)，westernblot分析β-catenin、cyclinD1、c-Myc蛋白表達(dá)

11、。
　　2.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色法+流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　3.高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加0.5mMLicl。于刺激后不同時(shí)間點(diǎn)分別收集5mM葡萄糖、2

12、5mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl處理的三組細(xì)胞，利用real-timePCR法、westernblot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)增殖、遷移及凋亡相關(guān)因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.高糖抑制β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表達(dá)，外源性添加Licl可上調(diào)β-catenin、cyclinD1、c-MycmRNA及蛋白表達(dá)，激活β-caten

13、in信號(hào)。
　　2.高糖抑制THCE細(xì)胞存活率，下調(diào)增殖相關(guān)因子ki-67mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+Licl組的細(xì)胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組，與正常組無顯著差異。
　　3.高糖抑制THCE細(xì)胞遷移能力，下調(diào)遷移相關(guān)因子MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)。高糖+Licl組的細(xì)胞遷移能力、MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于高糖組，但與正常組相比，仍存在差異。
　　4.高糖誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡，上調(diào)促凋

14、亡因子baxmRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)。添加Licl可改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及bax、bcl-2表達(dá)變化，但與正常組相比，存在顯著差異。
　　結(jié)論:
　　在THCE細(xì)胞中，高糖通過抑制β-catenin及下游靶基因cyclinD1、c-Myc的表達(dá)，引起ki-67、MMP-2、bcl-2表達(dá)下調(diào)、bax表達(dá)上調(diào)，從而降低THCE細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)THCE細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致角膜上皮細(xì)

15、胞創(chuàng)傷愈合延遲的原因之一。
　　第三部分:IGF-1調(diào)控β-eatenin信號(hào)參與高糖培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的研究
　　目的:
　　研究高糖培養(yǎng)的THCE劃傷后，外源性IGF-1對(duì)β-catenin信號(hào)表達(dá)的影響，明確IGF-1是否通過調(diào)控β-catenin信號(hào)共同參與高糖損害的角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合。
　　方法:
　　高糖預(yù)處理THCE細(xì)胞且生長(zhǎng)因子饑餓后，外源性添加IGF-1。對(duì)5mM葡萄糖、25mM

16、葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1處理的三組細(xì)胞，進(jìn)行劃傷刺激，于不同時(shí)間點(diǎn)利用real-timePCR法檢測(cè)β-catenin、cyclinD1mRNA表達(dá)，westernblot分析β-catenin、cyclinD1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　高糖抑制β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表達(dá)，外源性添加IGF-1可顯著上調(diào)高糖抑制的β-catenin、cyclinD1mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論: