PCM和TAT雙修飾脂質(zhì)體心肌靶向傳遞系統(tǒng)的研究.pdf

1、缺血性心臟病（Ischemic heart disease，IHD）是一類冠狀動(dòng)脈疾病，它是世界范圍內(nèi)最常見的死亡原因之一。國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的傳統(tǒng)療法有藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療三種，其中藥物治療安全有效，但許多治療藥物不能有效濃集于心肌，所以探索新的更具靶向性的藥物載體已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究趨勢(shì)。
　　脂質(zhì)體是最常用的靶向給藥系統(tǒng)之一，通過配體修飾脂質(zhì)體表面，脂質(zhì)體可經(jīng)受體或電荷介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，可有效地提高靶向效率，精確地

2、靶向靶細(xì)胞或靶組織，從而提高生物利用度，減少副作用。PCM（WLSEAGPVVTVRALRGTGSW）是通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的由20個(gè)氨基酸組成的肽段，是一種心肌細(xì)胞特異性靶向肽。TAT是近年來廣泛應(yīng)用于修飾藥物和藥物載體的一種細(xì)胞穿膜肽，它由11個(gè)氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成，可將與之相連的藥物或藥物載體以一種濃度依賴的方式高效、快速地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本文制備了PCM和TAT修飾的脂質(zhì)體，以香豆素-6和EGFP質(zhì)粒分別作為傳統(tǒng)

3、藥物和基因藥物的模型藥物。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質(zhì)體的心肌靶向性，結(jié)果表明，PCM和TAT雙修飾的脂質(zhì)體具有良好的心肌靶向性。通過體外實(shí)驗(yàn)初步研究了載EGFP質(zhì)粒的 PCM修飾的脂質(zhì)體的心肌轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明，PCM修飾的脂質(zhì)體具有良好的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。本文設(shè)計(jì)并構(gòu)建了PCM和TAT雙修飾的脂質(zhì)體，用以提高脂質(zhì)體向心肌的傳遞能力。
　　第一部分對(duì)載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾的脂質(zhì)體的制

4、備工藝和處方進(jìn)行了篩選。首先采用操作簡(jiǎn)單，制備工藝穩(wěn)定的薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體，再利用PCM-Cys和TAT-Cys中半胱氨酸的巰基與DSPE-PEG2000-MAL中馬來酰亞胺的雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，將多肽連接于脂質(zhì)體表面。以包封率為指標(biāo)，篩選了香豆素-6的最佳用量及PCM和TAT的連接方式。通過研究H9C2細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取率，篩選出PCM的最佳用量為脂質(zhì)的3%，TAT的最佳用量為脂質(zhì)的1%。篩選得到的雙修飾脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑

5、在115nm左右。
　　第二部分對(duì)載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質(zhì)體進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)，初步驗(yàn)證了雙修飾脂質(zhì)體的心肌靶向性。制備了載香豆素-6和未載香豆素-6的未修飾的普通脂質(zhì)體Lip，3%PCM修飾的脂質(zhì)體3%P-Lip，1%TAT修飾的脂質(zhì)體1%T-Lip以及1%PCM和1%TAT雙修飾的脂質(zhì)體3%P-1%T-Lip。通過CCK-8試驗(yàn)測(cè)定了各種未載香豆素-6的脂質(zhì)體的毒性，結(jié)果表明脂質(zhì)體用量小于等于0.4mM時(shí)，各種脂質(zhì)體

6、無明顯毒性。通過共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)定性和定量地研究了原代心肌細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝取，結(jié)果各種脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取率：3%P-1%T-Lip>3%P-Lip>1%T-Lip>Lip。同時(shí)還研究了游離多肽PCM和TAT對(duì)脂質(zhì)體攝取的影響，結(jié)果游離PCM抑制PCM修飾脂質(zhì)體的攝取，而游離TAT對(duì)TAT修飾脂質(zhì)體的攝取無明顯抑制。
　　第三部分對(duì)載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質(zhì)體進(jìn)行了體內(nèi)評(píng)價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證了雙修飾脂質(zhì)體的心肌靶向性

7、。首先對(duì)尾靜脈給予了載香豆素-6的各種脂質(zhì)體的昆明小鼠心臟組織冰凍切片進(jìn)行定性觀察，然后對(duì)尾靜脈給予載香豆素-6的各種脂質(zhì)體后香豆素-6在各臟器內(nèi)的含量采用HPLC-FLD法進(jìn)行定量測(cè)定。定性觀察和定量測(cè)定結(jié)果顯示各種脂質(zhì)體的心臟蓄積量：3%P-1%T-Lip>3%P-Lip>1%T-Lip>Lip，說明雙修飾脂質(zhì)體具有較好的心肌靶向性。3%P-1%T-Lip，3%P-Lip，1%T-Lip和Lip在肝、脾、肺、腎等器官也有一定的分布，

8、但3%P-1%T-Lip與對(duì)照組相比心肌蓄積量明顯增加，而在肝、脾、腎、肺的分布沒有明顯增高。
　　第四部分對(duì)載增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒（pEGFP）的PCM修飾脂質(zhì)體的制備工藝和體外靶向性進(jìn)行了研究，擬用于提高載基因治療藥物的脂質(zhì)體的心肌傳遞能力。此部分增加DOTAP為陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，采用薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體，再將DSPE-PEG2000-PCM制成膠束插入脂質(zhì)體。制備了未修飾的普通脂質(zhì)體LIP，1%PCM修飾的脂質(zhì)體1%

9、P-LIP，3%PCM修飾的脂質(zhì)體3%P-LIP和5%PCM修飾的脂質(zhì)體5%P-LIP。通過測(cè)定PCM的連接率篩選了PCM的連接方法，通過瓊脂糖凝膠電泳考察了脂質(zhì)體的載藥能力。通過定性觀察和定量測(cè)定考察了不同量PCM修飾脂質(zhì)體對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，篩選了PCM的最佳用量為3%。制備得到的載pEGFP的LIP和3%P-LIP的粒徑分別為212.4±2.95nm和261.9±2.20nm，連接PCM后脂質(zhì)體粒徑增大。
　　綜上所述，本