rAAV介導(dǎo)TPO基因修飾的骨髓MSCs對(duì)巨核系造血生成的作用研究.pdf

1、目的：對(duì)于腫瘤患者在接受高劑量放療、化療后，或非化療的病人如骨髓異常增生綜合征，先天性血小板減少性紫癜，慢性肝臟疾病等，血小板減少癥引起的出血是患者死亡的主要原因之一。血小板輸注治療是目前嚴(yán)重血小板減少癥的唯一的緊急治療措施。但是，血小板輸注仍然存在如異體免疫反應(yīng)，感染抗原的傳播，輸注反應(yīng)等嚴(yán)重的問題。因此，本研究擬通過rAAV介導(dǎo)TPo基因修飾骨髓MSCs，并探討其對(duì)巨核系造血的作用。 方法與結(jié)果： 1．骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

2、的分離與培養(yǎng)本研究采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外培養(yǎng)獲取人骨髓MSCs，分別誘導(dǎo)MSCs向成骨和成脂肪分化，采用Von Kossa法和油紅0染色分別檢測(cè)誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。結(jié)果表明通過體外原代和傳代培養(yǎng)獲得高效擴(kuò)增能力的MSCs，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力下降。向成骨誘導(dǎo)2周左右Von Kossa法染色可見大量黑色鈣鹽沉積；向成脂誘導(dǎo)3周油紅O染色顯示大量紅色脂滴。 2．骨髓MSCs條件培養(yǎng)液對(duì)誘導(dǎo)人巨核細(xì)胞系

3、Meg—01細(xì)胞分化的作用收集骨髓MSCs的條件培養(yǎng)液(MSCs—CM)，將MSCs—CM加入早期巨核祖細(xì)胞Meg—01細(xì)胞系的培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)Meg—01巨核細(xì)胞系分化成熟。NF—E2表達(dá)是巨核細(xì)胞生成血小板所必需的，RT—PCR結(jié)果表明，MSCs—CM處理的Meg—01細(xì)胞系NF-E2表達(dá)增強(qiáng)，說明MSCs—CM能促進(jìn)巨核細(xì)胞分化成熟。Altas cDNA expression array結(jié)果表明，與對(duì)照組比較(無MSCs—CM作用

4、的Meg-01細(xì)胞)，MSCs—CM作用的Meg-01細(xì)胞中7個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。 3. 骨髓MSCs條件培養(yǎng)液聯(lián)合TPO或IL-11對(duì)巨核系細(xì)胞體外生成的影響有文獻(xiàn)報(bào)道血小板生成素(TPO)或白細(xì)胞介素11(IL-11)是有效促進(jìn)巨核細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，本研究中比較骨髓MSCs-CM，MSCs-CM聯(lián)合TPO或MSCs-CM聯(lián)合IL-11對(duì)體外培養(yǎng)條件下骨髓來源的巨核系細(xì)胞生成的影響。結(jié)果表明：MSCs-CM，M

5、SCs-CM聯(lián)合TPO或MSCs-CM聯(lián)合IL-11均能促進(jìn)巨核系祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞的生成。與MSCs-CM單用或TPO單用比較，MSCs-CM和TPO聯(lián)用后對(duì)巨核系祖細(xì)胞和成熟巨核細(xì)胞的生成有明顯促進(jìn)作用，TPO與MSCs-CM具有協(xié)同作用；而IL-11與MSCs-CM聯(lián)合后，與MSCs-CM單用或IL-11單用比較，對(duì)巨核系細(xì)胞生成沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-11與MSCs-CM不具有協(xié)同作用。結(jié)果說明MSCs-CM與TPO聯(lián)合培養(yǎng)體系

6、將成為促進(jìn)巨核系細(xì)胞生成的一種有效方法。 4. 獲取攜帶TPO基因的重組腺相關(guān)病毒載體本研究中通過RT-PCR從人胎肝中擴(kuò)增出1059bp大小的TPO基因，將其克隆入pAAV-IRES-GFP質(zhì)粒中，通過酶切和測(cè)序鑒定，成功地構(gòu)建了重組pAAV-TPO-IRES-GFP(pAAV-TPO)質(zhì)粒；然后采用磷酸鈣共沉淀法將三質(zhì)粒pAAV-TPO，pAAV-RC，pHelper共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝含有TPO基因的rAAV-TP

7、O-IRES-GFP(rAAV-TPO)；通過"氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"三步法純化獲得rAAV-TPO；通過SDS-PAGE蛋白電泳和點(diǎn)雜交檢測(cè)，獲得高純度的滴度為2×10<'11>vg/ml的rAAV-TPO。然后，我們用rAAV-TPO-IRES-GFP(rAAV-TPO)轉(zhuǎn)染MSCs，TPO基因修飾的MSCs在mRNA水平和蛋白水平TPO的表達(dá)明顯增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其GFP的表達(dá)率為23.0％+7.18％.

8、 5. rAAV介導(dǎo)TPO基因修飾的MSCs對(duì)巨核系細(xì)胞體外生成的影響收集TPO基因修飾MSCs的條件培養(yǎng)液(TPO/MSCs-CM)，分析比較TPO/MSCs-CM和MSCs-CM對(duì)體外條件下誘導(dǎo)人骨髓來源的巨核系細(xì)胞生成的作用，結(jié)果表明，MSCs-CM和TPO/MSCs-CM均能促進(jìn)巨核系祖細(xì)胞和CD41陽性表達(dá)的巨核細(xì)胞生成，其中TPO/MSCs-CM促進(jìn)巨核系細(xì)胞生成的作用明顯強(qiáng)于MSCs-CM，說明用rAAV作為載體介導(dǎo)T

9、PO基因修飾的骨髓MSCs(TPO/MSCs)有望成為促進(jìn)巨核系細(xì)胞生成的安全有效的新方法。 6. 共移植TPO基因修飾的MSCs對(duì)NOD/SCID小鼠巨核系造血生成的作用在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用NOD/SCID小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討TPO/MSCs對(duì)巨核系細(xì)胞生成的作用。經(jīng)X射線照射后的NOD/SCID小鼠，輸注人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，同時(shí)共移植人骨髓來源的MSCs或者TPO基因修飾的MSCs(TPO/MSCs)，比較TP

10、O/MSCs或MSCs對(duì)動(dòng)物體內(nèi)巨核系細(xì)胞生成的作用。結(jié)果表明：MSCs與MNCs或TPO/MSCs與MNCs共移植小鼠后，在小鼠的各個(gè)組織(包括骨髓、外周血、脾臟和肝臟)中能檢測(cè)到人源細(xì)胞的Alu序列基因。共移植MSCs與MNCs或TPO/MSCs與MNCs后在骨髓和外周血中對(duì)人CD45陽性細(xì)胞植入率沒有差別。共移植MNCs與MSCs或MNCs與TPO/MSCs后，在小鼠骨髓中人源CD41陽性巨核細(xì)胞分別為0.98±0.65％和3.4

11、6±1.73％；小鼠骨髓每2×10<'5>個(gè)單個(gè)核細(xì)胞生成的CFU-MK數(shù)分別為6.20±3.70和20.40±7.16；用HE染色后觀察成熟多倍體巨核細(xì)胞，骨髓中分別為3.40±1.14和12.60±5.45、脾臟中分別為2.20±0.84和6.80±1.64、肝臟中分別為0和0.80±0.44。此外，移植后每3天計(jì)數(shù)外周血血小板數(shù)，結(jié)果表明共移植MSCs與MNCs或TPO/MSCs與MNCs均能促進(jìn)小鼠體內(nèi)血小板生成；并且TPO/M

12、SCs+MNCs組更能明顯地減輕外周血血小板下降的程度，能保持血小板在一定水平，同時(shí)縮短血小板恢復(fù)的時(shí)間，更加快速地促進(jìn)血小板的恢復(fù)。結(jié)論：本研究在體外成功地分離培養(yǎng)出具有高效擴(kuò)增能力和分化潛能的人骨髓MSCs；并且通過rAAV載體有效地介導(dǎo)TPO在MSCs中的表達(dá)，獲得TPO基因修飾的MSCs(TPO/MSCs)；進(jìn)一步研究表明TPO基因修飾的MSCs條件培養(yǎng)液(TPO/MSCs-CM)對(duì)于促進(jìn)骨髓巨核系細(xì)胞生成的作用明顯優(yōu)于單獨(dú)MS