HIF-lα基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、腦卒中引起的腦損傷是神經(jīng)外科常見(jiàn)的疾病，發(fā)病率和死亡率居腦血管病之首。根據(jù)原因可分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，無(wú)論是什么原因引起的腦損傷，神經(jīng)功能的損傷將是不可逆轉(zhuǎn)的。隨著科研和臨床研究的不斷深化和發(fā)展，抗凝治療、溶栓治療和介入治療取得了良好效果，但如何防止繼發(fā)性腦損傷的也是目前臨床面臨的難題。繼發(fā)性腦損傷腦功能的恢復(fù)有兩個(gè)關(guān)鍵因素，即血管再生與神經(jīng)細(xì)胞再生。干細(xì)胞移植和基因治療相結(jié)合，為治療腦損傷和神經(jīng)功能的恢復(fù)帶來(lái)了新的希望。

2、r>　　骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells，MSCs），成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，由于其來(lái)源豐富，采集方便同時(shí)具有較小的免疫反應(yīng)性，目前已廣泛應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，參與并保持在體內(nèi)的氧平衡，在病理?xiàng)l件下對(duì)缺血缺氧反應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)答，目前已知有70多個(gè)靶基因。在這項(xiàng)研究中，我們使用重組腺病毒HIF-1α

3、基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到局灶性腦缺血再灌注（MCAO）模型，進(jìn)一步研究HIF-1α的腦損傷保護(hù)作用。通過(guò)研究，我們發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的可促進(jìn)下游靶基因上調(diào)，從而促進(jìn)血管新生，改善腦組織的血液供應(yīng)，減少腦組織缺血、缺氧損傷。研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化和維持神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分：
　　第一部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　目的：通過(guò)分離培養(yǎng)骨髓

4、間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells，MSCs），鑒定其生物學(xué)特性，為組織的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用密度梯度離心法分離MSCs，倒置相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)變化；MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；細(xì)胞表型通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定；利用光鏡觀察分化能力。結(jié)果：密度梯度離心法能分離出較高純度的MSCs。流式細(xì)胞儀顯示：CD29(93.2％)、CD105(92.6％)、CD45(94.68％)、CD44(94.6％)、CD

5、73(86.4)、CD34(1.5％)、CD45(2.2％)、CD19(2.0％)、CD14(1.9％)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)細(xì)胞增殖的最高峰出現(xiàn)在第6至7d，其后細(xì)胞增殖速度迅速下降。光鏡下觀MSCs能夠在體外誘導(dǎo)分化成為成骨細(xì)胞與脂細(xì)胞。結(jié)論：采用密度梯度離心法成功的分離出高純度的MSCs是有效的方法。
　　第二部分重組腺病毒載體Ad.HIF-lα轉(zhuǎn)染MSCs
　　目的：構(gòu)建重組腺病毒Ad.HIF-lα并轉(zhuǎn)染MSCs，觀察轉(zhuǎn)

6、染HIF-lα外源性基因及蛋白在MSCs中的表達(dá)。方法：將在目的基因HIF-lα的上游引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引入XbaI酶切位點(diǎn)，對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1/HIF-lα進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序。體外分離、培養(yǎng)MSCs，腺病毒載體與HIF-lα基因連接，轉(zhuǎn)染MSCs，用Westernblot檢測(cè)HIF-lα蛋白表達(dá)。結(jié)果：雙酶切鑒定、測(cè)序和Westernblot結(jié)果顯示HIF-lα基因成功轉(zhuǎn)入腺病毒載體，并且能夠在MSCs中表達(dá)。結(jié)論：成

7、功構(gòu)建了重組腺病毒Ad.HIF-lα，并轉(zhuǎn)染到MSCs中。
　　第三部分：腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α基因轉(zhuǎn)染MSCs對(duì)腦損傷后血管生成、神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響
　　目的：觀察低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α）基因?qū)Υ笫竽X缺血再灌注后血管生成的影響，探討HIF-1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞人（Neuralstemcells，NSCs)增殖與分化的作用機(jī)制。方法:建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌

8、注(Ischemicreperfusioninjury,I/R)模型，大鼠隨機(jī)分為PBS組、MSC組和Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染MSC(Hy-MSC組)。分別將PBS、MSCHy-MSC定位注射到I/R模型大鼠腦缺血區(qū)，于7d、14d、21d進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分(Neurologicaldeficitscore,NDS)并比較。免疫組化檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)，Westentblot檢測(cè)皮層VEGF、EPO和Ang-1的表達(dá)，TUNEL檢測(cè)細(xì)

9、胞的調(diào)亡情況。結(jié)果:（1）Hy-MSC組在第7、14、21d的NDS優(yōu)于MSC組PBS組（P<0.05）；（2）與MSC組相比,Hy-MSC組增強(qiáng)了各時(shí)間點(diǎn)HIF-1、VEGF及EPO的表達(dá)；（3）Hy-MSC組和MSC細(xì)胞數(shù)明顯，但凋亡率下降，與PBS相比細(xì)胞調(diào)亡率(P<0．05)。結(jié)論:HIF-1α基因可促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血后血管生成，同時(shí)促進(jìn)MSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化，并維持NSCs的特性。
　　第四部分HIF-1α與Wnt信

10、號(hào)途徑的關(guān)系以及對(duì)NSCs特性的影響
　　目的：觀察HIF-1α對(duì)Wnt信號(hào)途徑的相互關(guān)系，以及在MSCs向NSCs分化、增殖中作用。方法:體外培養(yǎng)大鼠NSCs以及HIF-1α轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Hy-MSC）,利用免疫共沉淀觀察兩者之間存在聯(lián)系。為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，分別加入HIF-1α與Wnt的活化劑與抑制劑，通過(guò)Westernblot觀察下游基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascularendothelialgrowthfac

11、tor，VEGF）、促進(jìn)細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）、淋巴增強(qiáng)因子（Lymphoidenhancerfactor-1，LEF-1）、β-鏈蛋白（β-catenin）表達(dá)的變化。結(jié)果：（1）阻斷HIF-1α的表達(dá)，Wnt下游基因表達(dá)減少LEF-1（P<0.01）和β-catenin（P<0.05）。（2）阻斷Wnt的表達(dá)，對(duì)HIF-1α下游基因VEGF和EPO無(wú)明顯影響。（3）阻斷Wnt的表達(dá),HIF-1α的表達(dá)無(wú)影