氯丙嗪單獨及與順鉑聯(lián)合應用對宮頸癌hela細胞生長的研究.pdf

1、目的 宮頸癌(cervical carcinoma)是女性最常見的一種惡性腫瘤，它的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第二位。傳統(tǒng)的治療方法是早期手術，放療為主，化療為晚期或復發(fā)患者的治療方法。手術僅適于早期患者且創(chuàng)傷大，而放療后女性內分泌功能受到損害，導致患者生活質量嚴重下降尤其是年輕女性患者。傳統(tǒng)的化療藥物有不同程度的毒副作用并出現(xiàn)腫瘤對化療藥物的耐藥反應，最終導致治療失敗。隨著宮頸癌發(fā)病的年輕化和腺癌比例增加，患者對治療后

2、生活質量的要求更加提高。因此尋找一些毒性小、藥物反應少且有一定療效的藥物治療宮頸癌，或者利用它們增加化療藥物的敏感性就顯得極其重要。本研究旨在研究氯丙嗪(Chlorom-azine)單獨及與順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)聯(lián)合用藥對人宮頸癌hela細胞株體外生長的影響，以期為臨床上藥物治療宮頸癌提供新思路。 方法 1、細胞培養(yǎng)：常規(guī)方法復蘇凍存于液氮罐中的人宮頸癌hela．細胞

3、，接種于含10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，待細胞生長至70％融合時(約2—3天)，胰酶消化，制成單細胞懸液，以備實驗用。 2、采用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colofimetricassay,MTT)比色法檢測氯丙嗪、順鉑單獨用藥及氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥對該細胞增殖的影響，測定吸光度(OD)值。流式細胞儀(FCM)測定氯丙

4、嗪單獨及與順鉑聯(lián)合用藥對hela細胞周期分布和凋亡的影響；流式細胞儀間接免疫熒光技術分析氯丙嗪單獨及與順鉑聯(lián)合用藥后hela細胞bcl-2、Bax蛋白表達的變化；應用逆轉錄.聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測聯(lián)合用藥后2小時及4小時后bcl-2、Bax mRNA表達量的改變。以β-actin作為內參照標準，對擴增產(chǎn)物通過凝膠掃描儀進行DNA電泳條帶的光量子強度分析，分別將bcl-2、Bax/β-actin作為bcl-2、Bax mRNA表

5、達水平的參數(shù)，對bcl-2、Bax產(chǎn)物相對定量。 3、采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(IteractionIndex)，評價聯(lián)合后的作用。如果相互作用指數(shù)>1，為兩藥拮抗作用：相互作用指數(shù)=1，為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)<1，為兩藥協(xié)同作用。 結果 1、MTT比色法顯示氯丙嗪、順鉑單獨用藥，濃度分別為(1×10<'-4>、1×10<'-5>、1×10<'-5>mol/L)對hela細胞均

6、具有抑制增殖作用。不同濃度的氯丙嗪及順鉑處理細胞24-72h后，與對照組相比，各處理組OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。且隨著藥物濃度的增大、作用時間的延長，OD值逐漸下降。上述結果表明，氯丙嗪及順鉑對hela細胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量.效應和時間.效應依賴關系。 2、氯丙嗪(1×10<'-6>mol/L)與順鉑(1×10<'-4>、1×10<'-5>、1×10<'-6>mol/L)聯(lián)合用藥作用hela

7、細胞24-72小時后，與對照組相比，OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與順鉑單獨處理組相比，OD值有不同程度下降，差異具有顯著性(p<0.05)。且隨著順鉑濃度的增大、作用時間的延長，OD值逐漸下降。上述結果表明，氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥對hela細胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量一效應和時間.效應依賴關系，推測兩者之間有相互協(xié)同作用。 3、流式細胞儀檢測hela細胞周期分布和凋亡顯示：氯丙嗪單獨及聯(lián)合用藥24小時

8、后，隨藥物濃度增大，G0/G1期細胞逐漸增多；S期和G2/M期細胞則逐漸減少。且出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依濃度的增大而逐漸升高，凋亡百分率氯丙嗪組為32.97％：聯(lián)合用藥組分別為54.71％、65.11％。上述結果表明，氯丙嗪單獨及聯(lián)合用藥24小時后可阻滯hela細胞周期進程于G1期，該作用呈劑量-效應依賴關系，并且hela細胞凋亡百分率依濃度的增大而逐漸增加。 4、流式細胞儀間接分析細胞bcl-2、Bax蛋白表達顯示：含終濃

9、度為10<'-6>mol/L的氯丙嗪單獨及與含終濃度為10<'-5>、10<'-4>mol/L的順鉑聯(lián)合用藥24小時后bcl-2的熒光指數(shù)FI值隨處理組濃度增大而逐漸減少，Bax的熒光指數(shù)FI值隨處理組濃度增大而逐漸增大。對于每一種蛋白，比較其處理組和對照組的FI值，差異具有顯著性(p<0.05)。表明，氯丙嗪單獨及聯(lián)合用藥后hela細胞bcl-2蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調。 5、RT-PCR結果示：聯(lián)合用藥前后bcl-2

10、、Bax的mRNA表達量均改變，bcl-2的表達水平隨處理組時間的延長而逐漸減少，Bax的表達水平隨處理組時間的延長而逐漸增大。用藥前后bcl-2、Bax/β-actin比值對bcl-2、Bax產(chǎn)物相對定量，進行對比，有顯著差異(p<0.05)。表明，聯(lián)合用藥后hela細胞bcl-2 mRNA表達下調，Bax mRNA表達上調。 6、isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)顯示：氯丙嗪聯(lián)合順鉑在細胞生長抑制率為50％時

11、相互作用指數(shù)小于1。表明，氯丙嗪與順鉑聯(lián)合應用后對hela細胞的增殖抑制有協(xié)同作用。 結論 1、本試驗首次通過體外試驗證實氯丙嗪單獨及與順鉑聯(lián)合應用對hela細胞的生長有抑制作用。兩藥聯(lián)合應用為協(xié)同作用，對宮頸癌hela細胞的增殖有抑制作用且作用呈時間一劑量依賴關系。聯(lián)合用藥與順鉑單獨用藥的抑制率進行統(tǒng)計學處理，兩者有顯著的差異(p<0.05)，證實氯丙嗪有體外輔助化療的作用，亦可增加順鉑的敏感性。 2、本試驗證

12、實氯丙嗪與順鉑聯(lián)合用藥可阻滯宮頸癌細胞hela于G1期并可誘導該細胞凋亡。 3、我們通過流式檢測可初步推論氯丙嗪單獨及與順鉑聯(lián)合用藥均可下調bcl-2蛋白的表達和上調Bax蛋白的表達，通過RT-PCR的試驗結果進一步推測兩藥聯(lián)合應用后下調bcl-2基因的表達和上調Bax基因的表達，從而發(fā)揮其抑制宮頸癌細胞的增殖、誘導該細胞凋亡的作用。 4、本試驗證實了氯丙嗪這一臨床常用的抗精神失常藥在體外具有抑制腫瘤細胞生長的作用，與順