拉帕替尼聯(lián)合順鉑對宮頸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:宮頸癌是我國常見的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于乳腺癌位居第二位,每年有3萬患者死于宮頸癌。近20年來,隨著宮頸癌發(fā)病率的增加,患者呈現(xiàn)年輕化趨勢,其中宮頸腺癌所占比例也逐年升高,且與宮頸鱗癌比較,患者預(yù)后較差[1]。宮頸腺癌由于多屬于內(nèi)生型、易于深浸宮頸間質(zhì)、血管淋巴間隙,較早出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,這也是宮頸腺癌預(yù)后較差的因?yàn)?。目前以手術(shù)、放療、化療為主的綜合治療,可治愈大多數(shù)早、中期宮頸癌患者,但對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期宮頸癌患者并未取

2、得滿意的療效。
　　 晚期宮頸癌患者一般行以化療為主的姑息性治療,順鉑被認(rèn)為是治療宮頸癌最有效的化療藥物,被舉薦用于復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移宮頸癌的一線化療,但腫瘤細(xì)胞容易對其產(chǎn)生耐藥性。因此,進(jìn)一步對宮頸癌進(jìn)行研究,尋求新的治療方法和藥物顯得非常重要。腫瘤分子靶向治療是一種全新的生物治療模式,其從分子水平阻斷腫瘤惡性生物學(xué)行為,從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,甚至使腫瘤消退。
　　 表皮生長因子受體(EGFR/HER)家族由四個(gè)糖蛋白組

3、成,包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER-2)、ErbB3(HER-3)、ErbB4(HER-4)。EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物,是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。它與腫瘤的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制有關(guān)。研究表明EGFR可在宮頸癌患者中高表達(dá),其表達(dá)提示預(yù)后不良[2,3]。
　　 拉帕替尼(lapatinib,Tykerb)是一種喹唑啉胺類化合物,是口服的小分子EGFR/HER

4、-2雙受體酪氨酸激酶抑制劑,其化學(xué)名:二對苯基磺酸拉帕替尼單水合物(lapatinib ditosyla temonohydrate)。它通過抑制細(xì)胞內(nèi)的EGFR(ErbB-1)和HER-2(ErbB-2)的ATP位點(diǎn)阻止腫瘤細(xì)胞磷酸化和激活,阻斷EGFR(ErbB-1)和HER-2(ErbB-2)受體的下調(diào)信號,從而抑制腫瘤生長。拉帕替尼由英國葛蘭素史克公司研發(fā),2007年5月已被美國FDA批準(zhǔn)與卡培他濱聯(lián)合治療ErbB-2過度表達(dá),

5、既往接受過蒽環(huán)類、紫杉醇、曲妥珠單抗(赫賽汀)治療的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。拉帕替尼在宮頸癌方面已有一定的研究[4]。
　　 etherà go-go鉀通道(Eag1)是電壓門控性鉀通道Eag家族中的一個(gè)成員,該家族中的成員包括Eag(包括Eag1和Eag2)、Erg(包括3個(gè)成員)和Elk(包括2個(gè)成員)通道。人的Eag1基因的染色體位于lq32.1—2[5],它是1969年Kaplan在對乙醚麻醉時(shí)出現(xiàn)腿震顫的黑腹果蠅作突變

6、檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的獨(dú)立基因位點(diǎn)[6,7],屬電壓門控性鉀通道,通過去極化而激活,對K+和Ca2+均有通透性[8]。Eag1通道在大腦中表達(dá)豐富,但在外周正常組織的表達(dá)非常局限,研究發(fā)現(xiàn)在成肌細(xì)胞和胎盤可檢測到其表達(dá)[5,9]。Eag1在一些原代腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系中可特異性地高表達(dá),并與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[10,11]。
　　 因此,本課題選擇拉帕替尼及順鉑聯(lián)合作用于宮頸腺癌Hela細(xì)胞,通過研究兩藥

7、物在宮頸癌的體外抑制作用,以及拉帕替尼對宮頸癌細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、Eag1鉀離子通道的影響,以探討其可能作用機(jī)制,為宮頸癌的綜合治療、療效的提高提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章:拉帕替尼聯(lián)合順鉑(DDP)對Hela細(xì)胞體外生長的抑制作用,拉帕替尼對Hela細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　 材料和方法
　　 1.Hela細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳一次代,選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用；<

8、br>　　 2.用MTT法檢測Hela細(xì)胞生長曲線:設(shè)置正常組和空白對照組,細(xì)胞種板過夜后檢測OD值(490nm),連續(xù)10天在同一時(shí)間檢測,并用Excel繪制細(xì)胞生長曲線；
　　 3.宮頸癌Hela細(xì)胞EGFR、HER-2基因的表達(dá):待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％后收集細(xì)胞,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用一般PCR試劑盒于PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng),擴(kuò)增完成后行PCR產(chǎn)物凝膠電泳成像,在紫外燈下觀察EGFR、HE

9、R-2基因表達(dá)情況。
　　 4.將細(xì)胞分成4組,分別為拉帕替尼單藥組、DDP單藥組、拉帕替尼聯(lián)合DDP組、對照組。檢測細(xì)胞增殖抑制率時(shí)拉帕替尼藥物濃度分別為0.5、1、2、4、8、10、20μmol/L；DDP藥物濃度分別0.75、1.5、3、6、12、24、48μg/ml,分別于加藥后24h、48h、72h檢測。拉帕替尼聯(lián)合DDP組藥物濃度是1μmaol/L+0.75μg/ml、2μmol/L+1.5μg/ml、4μmol/L

10、+3μg/ml,藥物作用72h后檢測。倒置顯微鏡觀察,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡時(shí),拉帕替尼藥物濃度均為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L,藥物作用72h后檢測。
　　 5.采取上述分組,用MTT法檢測藥物對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制,根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。
　　 6.采用協(xié)同作用q值判斷拉帕替尼和DDP聯(lián)用的性質(zhì):q>1.15為協(xié)同作用,0.85≤q≤1.15為相加作用,q<0.85為拮抗作用

11、。
　　 7.采取上述分組,收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。
　　 8.統(tǒng)計(jì)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,各組間細(xì)胞抑制率比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率結(jié)果采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；多重比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P≤0.05(雙側(cè))表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 1.宮頸

12、癌Hela細(xì)胞生長曲線:從生長曲線觀察,種板后的Hela細(xì)胞第1～7天均呈指數(shù)生長,其中第4～7天生長最快,之后開始逐漸減慢。
　　 2.宮頸癌Hela細(xì)胞EGFR及HER-2的表達(dá):通過PCR的定性檢測,證明Hela細(xì)胞存在EGFR表達(dá),而未見HER-2的表達(dá)。
　　 3.拉帕替尼聯(lián)合DDP對人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長抑制作用:經(jīng)MTT法檢測,不同濃度、不同時(shí)間拉帕替尼或DDP單藥對人宮頸腺癌細(xì)胞均有抑制作用,并隨著濃

13、度的增高及時(shí)間的延長其抑制率顯著增高(P均<0.05)。部分拉帕替尼和DDP聯(lián)合組(1μmol/L+0.75μg/ml,4μmol/L+3μg/ml)較相應(yīng)濃度拉帕替尼組抑制率顯著增高(P<0.05),但較DDP單藥組抑制率無顯著差異(P>0.05)。4μmol/L+3μg/ml聯(lián)合用藥組顯示出相加作用(q=0.99),而1μmol/L+0.75μg/ml、2μmol/L+1.5μg/ml聯(lián)合用藥組表現(xiàn)為拮抗作用(q均<0.85)。

14、r>　　 4.拉帕替尼單藥作用于Hela細(xì)胞后在倒置顯微鏡下的形態(tài)觀察:對照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好,呈多邊形細(xì)胞,體積較大,胞漿豐滿,細(xì)胞邊界清楚。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均有不同程度的形態(tài)變化,細(xì)胞變圓,體積縮小,但細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。藥物濃度為2.0μmol/L,發(fā)生形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)量增多。高劑量組異常細(xì)胞更多見,細(xì)胞數(shù)量明顯減少；
　　 5.拉帕替尼單藥對人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響:對照組和1μmol/L、2

15、μmol/L、4μmol/L拉帕替尼組的G0/G1期、S期、G2/M期比率間有顯著差異(P<0.05)。G0/G1期隨著濃度的增高其比率呈上升趨勢,而G2/M期、S期則相反,呈下降趨勢。
　　 6.拉帕替尼單藥對人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響:1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L拉帕替尼單藥組能夠顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡,且隨給藥劑量的增加,凋亡率增高,較對照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 第二章:拉

16、帕替尼對宮頸腺癌Hela細(xì)胞Eag-1鉀離子通道表達(dá)的影響
　　 材料和方法
　　 1.Hela細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),3-5天傳一次代,選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用；
　　 2.實(shí)驗(yàn)分為對照組,拉帕替尼單藥組(1、2、4 umol/L),加藥培養(yǎng)72h后提取RNA或全蛋白檢測。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot檢測Hela細(xì)胞Eag1基因的表達(dá)

17、變化。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；多重比較均采用LSD檢驗(yàn)。取P≤0.05(雙側(cè))表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:與對照組相比,拉帕替尼用藥組(1、2 umol/L)Eag1基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01),而拉帕替尼4 umol/L用藥組未檢測到Eag1基因表達(dá)。

18、　　 結(jié)論:EGFR基因在宮頸癌Hela細(xì)胞中表達(dá),可以作為宮頸癌治療靶點(diǎn)。拉帕替尼、DDP單藥對宮頸癌Hela細(xì)胞均有抑制增殖作用,呈劑量和時(shí)間依賴性；兩藥聯(lián)合高劑量組表現(xiàn)為相加作用。拉帕替尼單藥作用Hela細(xì)胞后,細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞較對照組顯著增多,S、G2/M期細(xì)胞則較對照組顯著減少。拉帕替尼能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡,并隨給藥劑量的增加,凋亡率顯著增高。拉帕替尼作用Hela細(xì)胞后Eag1鉀離子通道表達(dá)顯著下調(diào),認(rèn)為