TFPI-2基因原核表達(dá)及重組TFPI-2生物活性研究.pdf

1、第一部分人TFPI-2 cDNA在原核中表達(dá)的研究;目的:探索構(gòu)建人TFPI-2基因的原核表達(dá)載體及其在大腸桿菌中有效表達(dá)的方法,以獲得豐富的具有生物活性的重組TFPI-2蛋白,用于基礎(chǔ)和臨床研究.方法以編碼人TFPI-2蛋白的cDNA為模板,加上特殊設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,在引物設(shè)計(jì)時(shí)將引物中的CTG(Asp)變成GGA(Gly),達(dá)到點(diǎn)突變的目.經(jīng)酶切回收的原核表達(dá)載體pET28a的DNA片段,與擴(kuò)增后的目的基因片段連接.將已連接有人T

2、FPI-2基因DNA的pET28a載體轉(zhuǎn)到DH5a菌株中培養(yǎng),取單個(gè)菌落做菌落PCR鑒定.將插入了TFPI-2基因的pET28a載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株,以IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定.陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni親和層析和透析得到融合蛋白.第二部分重組TFPI-2抑制纖溶酶活性研究;目的:證實(shí)非糖基化重組TFPI-2具有抑制纖溶酶的活性.方法:應(yīng)用酶促動(dòng)力學(xué)分析方法,選擇u-PA活化PLg時(shí),P

3、Lg的合適底物濃度、溫度及時(shí)間,建立TFPI-2抑制纖溶酶的測(cè)定方法并進(jìn)行抑制動(dòng)力學(xué)分析.然后分別測(cè)定重組TFPI-2對(duì)液相和固相中的纖溶酶的抑制作用.第三部分重組TFPI-2影響人卵巢癌細(xì)胞體外遷徙浸潤(rùn)能力的研究;目的:從功能角度研究重組TFPI-2對(duì)人卵巢癌細(xì)胞體外遷徙浸潤(rùn)能力的影響.方法:1、遷徙實(shí)驗(yàn)加不同濃度TFPI-2培養(yǎng)的A2780細(xì)胞和不加TFPI-2的A2780細(xì)胞,通過(guò)Boyden小室體外浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移模型,以遷徙到PVPF