人分泌磷蛋白2(SPP2)基因的克隆、原核表達(dá)與活性檢測.pdf

1、目的：分泌磷蛋白2(Secreted Phosphorprotein2，SPP2)是最初從牛骨密質(zhì)中分離純化的一種非膠原基質(zhì)蛋白質(zhì)，由于在其第131到139位氨基酸殘基處存在一段富含磷酸化絲氨酸的序列且分子量約為24kDa，因而又被稱為分泌磷蛋白24(SPP24)。研究表明，SPP2可抑制半胱氨酸蛋白酶、參與骨形成、存在于血清胎球蛋白礦物質(zhì)復(fù)合物(FMC)中并抑制鈣化作用，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究的目的就是通過基因工程技術(shù)，將人SP

2、P2成熟蛋白基因片段克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從而獲得高純度的重組蛋白并檢測其生物學(xué)活性。
　　 方法：提取人肝癌組織總RNA，通過RT-PCR方法擴(kuò)增人SPP2成熟蛋白編碼區(qū)基因并克隆至原核表達(dá)載體pET-22b(+)，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，用Ni-NTA柱層析進(jìn)行純化，SDS-PAGE及Western-blot檢測、鑒定目的蛋白的表達(dá)。通過重組蛋白對木瓜蛋白酶的抑制

3、作用檢測其生物學(xué)活性。在不同時間、溫度下對重組蛋白進(jìn)行熱處理，研究其對木瓜蛋白酶抑制作用的影響。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒測序和酶切結(jié)果顯示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b(+)。IPTG誘導(dǎo)重組菌后有25kDa大小的目的蛋白表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后獲得可溶性表達(dá)的目的蛋白，純化后純度達(dá)90％，Western-blot表明其具有His標(biāo)簽抗原活性。重組SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用(酪蛋白為底物)，重量抑制

4、比為1:3.1，抑制比活性為2511U/mg。對重組SPP2進(jìn)行熱處理，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，重組SPP2對木瓜蛋白酶的抑制活性明顯降低。
　　 結(jié)論：本研究采用基因工程的方法，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)了具有生物學(xué)活性的可溶性人SPP2成熟蛋白。木瓜蛋白酶是典型的半胱氨酸蛋白酶，本研究通過實(shí)驗(yàn)檢測了重組SPP2對木瓜蛋白酶的抑制作用，表明SPP2具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑活性，為進(jìn)一步研究SPP2的生理功能和作