TFPI-2基因的克隆表達(dá)及其與肝癌關(guān)系的研究.pdf

1、目的：克隆中國(guó)人的TFPI-2基因(全長(zhǎng)cDNA)，并將之亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體并在細(xì)胞中表達(dá)，以此獲得首個(gè)中國(guó)人TTPI-2的cDNA克??；通過(guò)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2，研究TFPI-2的表達(dá)對(duì)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，探討TFPI-2在肝癌這一類具高度侵襲、轉(zhuǎn)移性腫瘤中的作用；為尋找新的抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的治療方法提供思路。 方法：第一階段：提取人肝臟總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出TFPI-2的全長(zhǎng)cDNA；PCR產(chǎn)物插入載體

2、PCR2.1中，選擇轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行酶切鑒定，DNA測(cè)序并和GeneBank中報(bào)道的TFPI-2序列比較，肯定克隆結(jié)果。用內(nèi)切酶切下TTPI-2的cDNA，亞克隆至高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中。第二階段：酶切鑒定后，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000把TFPI-2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中進(jìn)行瞬間高效表達(dá)，Western blot檢測(cè)其表達(dá)效果。同時(shí)使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。第三階段：以TFPI

3、-2 cDNA為探針，檢測(cè)TFPI-2基因在正常人肝組織、硬化肝、肝癌組織中表達(dá)的差異。用腫癌細(xì)胞趨化性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞趨化性變化；用腫瘤侵襲試驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染前后HepG2細(xì)胞的侵襲力改變。 結(jié)果：本研究克隆的中國(guó)人TFPI-2基因cDNA全長(zhǎng)1222bp，除258、585和884 bp處與目前Genbank中收錄的國(guó)外學(xué)者克隆的TFPI-2基因序列不同外，其他完全一致。序列Genbank登記號(hào)：TFPI AY691

4、946。TFPI-2成功插入pcDNA3.1表達(dá)載體，酶切鑒定其長(zhǎng)度和方向均正確，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)其正確的載入。將重組的TFPI-2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功的HepG2細(xì)胞經(jīng)證實(shí)有TFPI-2 mRNA和相應(yīng)蛋白的表達(dá)；而未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞沒(méi)有觀察到TFPI-2的表達(dá)。轉(zhuǎn)染TFPI-2的肝癌細(xì)胞HepG2其遷徙能力無(wú)明顯變化(穿膜細(xì)胞數(shù)為115.3±6.0 vs 121.7±7.1，P>0.05)，但是其細(xì)胞體