TFPI-2基因CpG島在甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病中的甲基化狀態(tài)及意義.pdf

1、目的:
　　 甲狀腺癌是一種較常見的惡性腫瘤，乳頭狀甲狀腺癌約占甲狀腺癌的60％。乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫均表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)結(jié)節(jié)性腫塊，早期臨床表現(xiàn)相似。甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫為良性甲狀腺病變，10～18％的良性甲狀腺病變會(huì)轉(zhuǎn)化成惡性病變。浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致甲狀腺癌治療失敗和患者死亡的主要原因。因此，尋找乳頭狀甲狀腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志非常重要。抑癌基因的失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生與演進(jìn)過程中的重要機(jī)制?；騿?/p>

2、動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致基因失活最常見的表觀遺傳機(jī)制。尋找可用于腫瘤診斷、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移判斷及預(yù)測(cè)良性結(jié)節(jié)惡性變的表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)志已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，以期為臨床診治提供理論依據(jù)。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)和跨膜絲氨酸蛋白酶（transmembraneproteaseserine4，TMPRSS4）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)中

3、成分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲的和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與患者愈后密切相關(guān)。組織因子途徑抑制物-2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)可抑制TMPRSS和MMPs對(duì)ECM的破壞作用，從而抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。TFPI-2基因具有典型的管家基因特征，在大多數(shù)人類組織中表達(dá)，但在起源于這些組織的腫瘤中，常因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化而表達(dá)降低或不表達(dá)，因此，TFPI-2基因被認(rèn)為可能是腫瘤抑制因子。本研究

4、擬應(yīng)用結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和乳頭狀甲狀腺癌組織標(biāo)本及人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞和人髓樣甲狀腺癌TT細(xì)胞為研究對(duì)象，探討TFPI-2基因在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)差異，探討該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)對(duì)其表達(dá)的影響及在乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。以期為甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病的鑒別診斷和乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的判斷提供表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，為甲狀腺疾病良性結(jié)節(jié)惡性變的早期發(fā)現(xiàn)提供線索。
　　 本論文分三部分:

5、r>　　 第一部分:甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病中TFPI-2的表達(dá)及其在乳頭狀甲狀腺癌中與TMPRSS4和MMP-1表達(dá)的關(guān)系
　　 方法:
　　 1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、20例甲狀腺腺瘤和40例乳頭狀甲狀腺癌組織（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例）中TFPI-2蛋白的表達(dá)情況及在40例乳頭狀甲狀腺癌組織中TFPI-2、TMPRSS4和MMP-1蛋白的表達(dá)情況，分析TFPI-2在三種不同甲狀腺

6、結(jié)節(jié)性疾病中蛋白表達(dá)差異及其在乳頭狀甲狀腺癌中與TMPRSS4和MMP-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，分析乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2、TMPRSS4和MMP-1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用列聯(lián)表分析(crosstabs)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化結(jié)果顯示:結(jié)節(jié)性甲狀腺

7、腫組織中TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為83.3％，甲狀腺腺瘤組織中TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為65.0％，甲狀腺乳頭狀癌組織中TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為52.5％，組間相比差異有顯著性，x2=7.221，P=0.027;TFPI-2蛋白在伴轉(zhuǎn)移乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)低于無轉(zhuǎn)移甲狀腺乳頭狀癌組織中TFPI-2蛋白的表達(dá)，差異有顯著性x2=4.821，P=0.028;TMPRSS4和MMP-1蛋白在伴轉(zhuǎn)移乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)

8、均高于無轉(zhuǎn)移甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)，差異有顯著性，x2值分別為4.835和6.852;P值分別為0.028和0.009。
　　 2.相關(guān)分析顯示:乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2蛋白與TMPRSS4、MMP-1蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.383和-0.339，相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)P值分別為0.015和0.032。
　　 第二部分甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及意義
　　 方

9、法:
　　 1.采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylationspecific-polymerasechainreaction，MSP)方法檢測(cè)30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、20例甲狀腺腺瘤和40例乳頭狀甲狀腺癌中TTFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，分析結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與TFPI-2蛋白表達(dá)的關(guān)系，分析乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)

10、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用列聯(lián)表分析(crosstabs)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.MSP結(jié)果顯示:結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為16.7％，甲狀腺腺瘤組織中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為25.0％，乳頭狀甲狀腺癌組織中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為

11、50.0％。組間相比差異有顯著性，x2=9.722，P=0.008。乳頭狀甲狀腺癌（伴轉(zhuǎn)移）組織中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為88.9％，乳頭狀甲狀腺癌（無轉(zhuǎn)移）組織中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為18.2％，組間相比差異有顯著性，x2=19.798，P=0.000。
　　 2.相關(guān)分析顯示:結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與TFPI-2蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r分

12、別為:-0.760、-0.545、-0.651，P值分別為:0.000、0.020、0.000。
　　 第三部分甲狀腺癌細(xì)胞系中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其對(duì)TFPI-2、TMPRSS4和MMP1表達(dá)的影響
　　 方法:
　　 1.以人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞和人髓樣甲狀腺癌TT細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MSP檢測(cè)5-氮雜胞苷(5-aza-deoxycytidine，5-aza-dc)處理與未處理

13、組TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　 2.采用Westernblotting方法檢測(cè)5-aza-dc處理與未處理組TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2、TMPRSS4和MMP1的蛋白表達(dá)。分析5-aza-dc對(duì)TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響及甲基化狀態(tài)與TFPI-2、TMPRSS4和MMP1蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用((x)±s)表示;計(jì)量資料采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.MSP結(jié)果顯示:甲狀腺癌TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)處于甲基化高狀態(tài)，而5-aza-dc處理后TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)呈去甲基化狀態(tài)。
　　 2.Westernblotting結(jié)果顯示，5-aza-dc處理組TPC-1和TT細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)織

15、高于5-aza-dc未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t值分別為:32.704和18.432，P值分別為:0.000和0.000;而5-aza-dc處理組TPC-1和TT細(xì)胞中TMPRSS4和MMP1蛋白低于5-aza-dc未處理組，P值均小于0.01。
　　 結(jié)論
　　 1.TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化可能是乳頭狀甲狀腺癌中TFPI-2失活的重要機(jī)制
　　 2.TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和

16、TFPI-2蛋白表達(dá)可能是結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤和乳頭狀甲狀腺癌的鑒別診斷的重要分子標(biāo)志。
　　 3.TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)、TFPI-2、TMPRSS4和MMP-1蛋白表達(dá)可能與乳頭狀甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移存在密切的關(guān)系。
　　 4.TFPI-2在乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中的作用可能與TFPI-2因基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化而表達(dá)降低，從而使MMP-1和TMPRSS4表達(dá)增高有關(guān)。
　　 5.TFPI-2可能成為檢

17、測(cè)良性結(jié)節(jié)惡性變的指示因子。
　　 本研究創(chuàng)新點(diǎn):
　　 甲狀腺癌的發(fā)病率不斷上升，且部分良性結(jié)節(jié)會(huì)發(fā)生惡性變，但少有人關(guān)注。以結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤、乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，從組織和細(xì)胞培養(yǎng)等不同角度探討了TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其在乳頭狀甲狀腺癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺腺瘤的鑒別診斷中的意義。為甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病的鑒別診斷和乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的判斷提供了新的