STAT3在激光誘導的大鼠脈絡膜新生血管中的表達及其對缺氧誘導的人視網膜色素上皮細胞血管內皮生長因子表達的影響.pdf

1、研究背景：脈絡膜新生血管(CNV)發(fā)生于多種眼部疾病，如年齡相關性黃斑變性(AMD)、眼組織胞漿菌病(OHS)、病理性近視和眼外傷等。CNV常累及黃斑，可因反復滲出、出血及瘢痕形成導致中心視力喪失，是主要致盲原因之一。當前眼科界關于CNV生成機制的研究已成為熱點，以期尋找能夠有效防治CNV的途徑。
　　CNV的病因尚未闡明，缺血缺氧可能是CNV形成重要的始動因素。局部微環(huán)境的改變可致脈絡膜毛細血管閉塞、萎縮以及纖維化等引起脈絡膜供

2、血不足，因而視網膜缺血缺氧，刺激視網膜色素上皮(RPE)細胞分裂和增生，并分泌血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等多種細胞因子，導致脈絡膜毛細血管向外層視網膜代償性生長，最后形成CNV。
　　VEGF是迄今為止發(fā)現的作用最強的促血管形成因子，也是重要的促細胞分裂素，缺氧可上調其表達。RPE細胞是CNV中主要的細胞成分，缺氧誘導RPE細胞表達VEGF可能是CNV發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。VEGF受多種刺激因素的影

3、響，牽涉的分子生物學機制十分復雜，這使得以抑制VEGF為目的的治療手段受到很大挑戰(zhàn)。
　　雖然VEGF的誘導因素眾多，但研究表明缺氧誘導因子1(HIF-1)和信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)是細胞內兩種關鍵性轉錄激活因子，可作用于VEGF啟動子，直接調控VEGF的表達。HIF-1是缺氧反應中一個重要的調節(jié)因子，通過與基因啟動子、增強子或其他調控區(qū)內的HIF-1特異組合序列結合，參與缺氧誘導VEGF等基因的表達，在血管形成過程

4、中發(fā)揮重要作用。STATs是一類通過酪氨酸磷酸化激活的具有SH2同源結構域的轉錄因子家族，多種細胞因子和生長因子等多肽類配體可參與其激活。實驗表明，STAT3參與了細胞對缺氧的應答，缺氧2h時即觀察到肺動脈平滑肌細胞內磷酸化STAT3蛋白表達顯著升高。近期研究發(fā)現，STAT3的異?；罨谡T導腫瘤新生血管的形成中具有重要作用。缺氧可激活人腎癌細胞JAK2/STAT3信號轉導通路，并通過活化HIF-1α蛋白協(xié)同調控VEGF表達，促進血管發(fā)生

5、。
　　目的：
　　(1)觀察激光誘導的大鼠CNV形成早期磷酸化STAT3的定位；
　　(2)建立體外培養(yǎng)的人RPE細胞物理缺氧模型，觀察缺氧狀態(tài)下RPE細胞STAT3的活性變化；
　　(3)運用JAK2激酶抑制劑AG490研究JAK2/STAT3信號轉導通路對缺氧誘導的體外培養(yǎng)的人RPE細胞增生以及HIF-1α活化和VEGF表達的影響。
　　方法：
　　(1)建立激光誘導的BN大鼠CNV模型，以免疫

6、熒光法觀察CNV生成早期磷酸化STAT3的定位；
　　(2)將培養(yǎng)的人RPE細胞置于含體積分數為1％O2、5％CO2和94％N2的培養(yǎng)箱內建立缺氧模型，分別培養(yǎng)1、3、6、12和24h。采用RT-PCR和Western blot方法觀察STAT3及其磷酸化表達水平的變化，免疫熒光法觀察RPE細胞內STAT3定位的改變；
　　(3)用30μMJAK2激酶抑制劑AG490處理RPE細胞，在缺氧條件下分別培養(yǎng)1、3、6、12和24

7、h，用流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測JAK2/STAT3信號通路阻斷前后缺氧RPE細胞的增生指數，以RT-PCR和Western blot方法觀察HIF-1αmRNA和蛋白的表達，RT-PCR觀察VEGFmRNA表達，ELISA檢測人RPE細胞上清中VEGF的含量。
　　結果：
　　(1)在激光誘導的大鼠CNV生成第3d，即可見磷酸化STAT3高表達于CNV區(qū)域，且主要定位于參與CNV生成的增生移行的

8、RPE細胞中；
　　(2)RT-PCR和Western blot顯示，正常培養(yǎng)的人RPE細胞內STAT3mRNA和蛋白表達量微弱。隨缺氧時間的延長，STAT3表達量逐漸增強，至12h達到峰值，24h開始下降，但仍高于常氧狀態(tài)；免疫熒光顯微鏡觀察，常氧狀態(tài)下，STAT3蛋白熒光主要分布于RPE細胞胞質內。缺氧后，細胞質內綠色熒光強度減弱，細胞核熒光強度明顯增強；
　　(3)FCM檢測AG490處理組細胞增生指數明顯低于對照組(

9、P<0.05)；隨缺氧時間的增加，RT-PCR顯示HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達逐漸增強，至6h達峰值；Western blot檢測缺氧后HIF-1α逐漸被活化，至12h達到峰值，24h開始下降；AG490處理組較對照組中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表達以及HIF-1α蛋白的活化均受到明顯抑制；ELISA證實，缺氧條件下培養(yǎng)的人RPE細胞上清液中VEGF含量隨時間逐漸增加，而AG490處理組RPE細胞條件培養(yǎng)液中