人腦膠質(zhì)瘤中miR-451通過(guò)CAB39基因調(diào)控P13K-AKT通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，具有高致命性和侵襲性，平均生存期為9-12個(gè)月。盡管對(duì)癌癥的基礎(chǔ)生物學(xué)研究和對(duì)其他腫瘤的治療有了很大進(jìn)展，但對(duì)于膠質(zhì)瘤的診斷及治療在過(guò)去的四十年中沒(méi)有明顯進(jìn)展[1，2]。這其中最主要的原因是我們對(duì)膠質(zhì)瘤的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。現(xiàn)有的綜合治療方法主要包括外科手術(shù)切除、術(shù)后放化療以及免疫治療等，治療效果差，復(fù)發(fā)率高，臨床預(yù)后較差。因此，尋找、研究與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因、信號(hào)通路及

2、分子病理機(jī)制，開(kāi)拓膠質(zhì)瘤的治療新策略和新手段便成為神經(jīng)外科的重要課題之一。
　　近些年的研究表明，在人腦膠質(zhì)瘤中某些microRNA呈現(xiàn)異常表達(dá)，這其中包括miR-451[3]。通過(guò)對(duì)miRNA的研究為探索腫瘤的發(fā)生機(jī)制和治療方法提供了全新思路[4]。miRNA是一類微小(～22nt)非編碼RNA，其作用主要是通過(guò)與靶基因的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3’UTR)特異性結(jié)合，致使靶基因降解或抑制其的翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5-11]

3、。這些miRNA在細(xì)胞凋亡、增殖、分化、生長(zhǎng)和代謝中發(fā)揮重要作用[12-14]。特別是相對(duì)于正常組織，腫瘤組織中miRNA表達(dá)量的異常改變更顯得尤為重要15。
　　miR-451位于染色體17q11.2，與原癌基因ERBB2(17q12)區(qū)域相鄰[16，17]。研究表明miR-451可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[3]、增殖、侵襲并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力[18]。異常表達(dá)miRNA的相關(guān)靶基因的確定有助于更加準(zhǔn)確的闡明miRNA在癌癥生物學(xué)中的作用[

4、15]。我實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，miR-451很可能通過(guò)調(diào)控AKT的表達(dá)，從而影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值、侵襲以及凋亡。故本課題通過(guò)對(duì)比miR-451在正常腦組織及膠質(zhì)瘤不同級(jí)別中表達(dá)量情況、尋找其靶點(diǎn)并探索可能存在的作用機(jī)制，以期為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供全新方法及思路。
　　本課題研究分為以下四個(gè)部分：
　　第一部分中應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)的方法，我們檢測(cè)了5例正常腦組織、41例不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織和4個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

5、系中miR-451的表達(dá)水平。結(jié)果表明miR-451的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中較正常組織顯著下降，并與腫瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)。此外，我們又應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)5例正常腦組織及75例膠質(zhì)瘤制備的組織芯片中miR-451的表達(dá)，得到了與RT-PCR一致的檢測(cè)結(jié)果。
　　第二部分為miR-451對(duì)P13K/AKT通路調(diào)控的研究。此部分實(shí)驗(yàn)采用TargetScan5.1、STRING[19]蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、KEGG[20]代謝網(wǎng)絡(luò)、miRNA靶向基因

6、預(yù)測(cè)軟件[21]、RNAhybrid[22]程序來(lái)尋找miR-451靶基因；應(yīng)用寡核苷酸has-miR-451mimics轉(zhuǎn)染4個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-451的表達(dá)效果；應(yīng)用Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics后目標(biāo)基因的表達(dá)變化；應(yīng)用熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miR-451靶基因；應(yīng)用免疫組化檢測(cè)靶基因與膠質(zhì)瘤級(jí)別間的相關(guān)性變化；最后應(yīng)用Westernblot檢測(cè)P13K/AKT通路上相關(guān)基

7、因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，應(yīng)用STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示AKT1與AKTIP和YWHAZ存在直接相關(guān)性，與CAB39存在間接相關(guān)性，這三個(gè)基因均為miR-451的靶基因，KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)分析顯示存在CAB39-AMPK-mTOR-AKT1通路。因此STRING蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)共同指向CAB39可能為hsa-miR-451靶基因。轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics后腫瘤細(xì)胞miR-451表達(dá)明顯升高，CA

8、B39表達(dá)量降低。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示較control組、scramble組及pGL3-CAB39-3’UTR-Mut組，共轉(zhuǎn)染has-miR-451mimics和pGL3-CAB39-3’UTR-wild質(zhì)粒時(shí)熒光強(qiáng)度顯著增高。故可推斷CAB39是miR-451靶基因。我們之前的通過(guò)RT-PCR和原位雜交研究顯示miR-451的表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，在此我們應(yīng)用免疫組化發(fā)現(xiàn)了一個(gè)相似結(jié)果，CAB39基因的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤WHO級(jí)別

9、呈現(xiàn)正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，miR-451很可能通過(guò)調(diào)控AKT的表達(dá)，從而影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值、侵襲以及凋亡，因此，我們研究了AKT相關(guān)通路，轉(zhuǎn)染miR-451mimics后U251，LN229，A172andU87細(xì)胞系中，miR-451過(guò)表達(dá)使得AKT相關(guān)通路上的LKB1，AMPK，P-AMPK，及P13K表達(dá)量明顯下降。這些數(shù)據(jù)表明miR-451很可能通過(guò)P13K/AKT通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。
　　第三部分

10、構(gòu)建LN229裸鼠皮下荷瘤模型，以進(jìn)一步研究miR-451的抑瘤作用及其對(duì)P13K/AKT的信號(hào)通路的調(diào)控。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至直徑約5mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為三組(每組6只)：control組、scramble組和miR-451mimics組，并在腫瘤局部多點(diǎn)注射治療，治療每3天一次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每3天測(cè)量一次腫瘤體積。21天觀察期結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，福爾馬林固定，石蠟包埋，免疫組化檢測(cè)腫瘤標(biāo)本的相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，miR-

11、451mimics組對(duì)裸鼠移植瘤的抑瘤作用較對(duì)照組及scramble組明顯增強(qiáng)(均P<0.01)；miR-451mimics組中P13K/AKT通路中的LKB1，AMPK，p-AMPK，P13K，p-AKT。蛋白表達(dá)量較control組和scramble組顯著降低。
　　結(jié)論：miR-451在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤標(biāo)本中低表達(dá)，并與腫瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，蛋白免疫印跡檢測(cè)和熒光素酶實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)CAB39基因?yàn)閙i